間充質(zhì)干細胞外泌體作用機制的研究進展*

蔡雨孜，崔換天，王 麗，邊育紅

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

間充質(zhì)干細胞（MSC）屬成體干細胞（ASCs），其來源組織豐富，如：骨髓、臍帶組織、胎盤組織等，具有多向的分化潛能[1-2]，又因便于采集，免疫排斥低，倫理爭議小等優(yōu)點[3]備受青睞，成為再生醫(yī)學研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)MSC參與機體免疫調(diào)節(jié)，組織修復和血管生成等過程，具有改善肝纖維化、慢性腎損傷、心血管再灌注損傷等作用。然而，單純的MSC移植可能存在栓塞，異常分化和腫瘤形成的風險，這些因素限制了MSC的運用[4]。

MSC被募集到受損組織，通過旁分泌作用分泌細胞因子，改善微環(huán)境，誘導受損器官組織結(jié)構(gòu)功能修復。在旁分泌機制中，細胞分泌的微囊泡是細胞交流的主要方式，外泌體即是其中一種。外泌體廣泛分布于體液中，包括血液、唾液、腦脊液等，可來源于多種細胞，其中以MSC分泌外泌體（MSC-exo）能力較強[5]。目前，已有很多文獻報道MSC-exo有MSC相似功能[6]，與單純應(yīng)用MSC相比，具有性質(zhì)穩(wěn)定、方便保存，無免疫原型的特點[7]，更好彌補MSC移植應(yīng)用中的不足，這使得MSC-exo備受矚目，外泌體及MSC-exo作用機制逐漸被發(fā)現(xiàn)。

1 外泌體的生物學特性

1.1 外泌體的起源與結(jié)構(gòu) 外泌體是細胞胞膜系統(tǒng)通過主動分泌排出的一種直徑40～150 nm的盤狀小囊泡[8]。目前認為，外泌體產(chǎn)生的過程主要由其來源細胞通過“內(nèi)陷-融合-外排”的過程分泌，可概括為三步，第一，細胞質(zhì)膜凹陷形成細胞內(nèi)小泡；第二，細胞內(nèi)小泡進一步發(fā)展成多泡小體；第三，多泡小體與細胞質(zhì)膜融合釋放外泌體，受體細胞對外泌體的接受可以通過配體-受體相互作用，胞飲/吞噬或膜融合來實現(xiàn)[9-10]。外泌體是本質(zhì)是脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，其中，大部分功能性分子是蛋白質(zhì)，一類是富含具有外泌體膜交換以及膜融合作用的膜聯(lián)蛋白，一類是可以調(diào)節(jié)外泌體膜和受體細胞的融合的Rabs蛋白，此外，外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63，CD9和CD81）、熱休克蛋白以及乳凝集素等[11]。不同來源的外泌體其合成分泌的RNA具有不同的結(jié)構(gòu)，大量研究表明外泌體中的RNA可調(diào)控生物信息，從而影響機體生理過程[12-13]。外泌體中還含有多種脂肪酸，膽固醇和鞘磷脂，這些脂質(zhì)不但作為運輸信號分子的載體，還起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用[14]。

1.2 外泌體的功能與特性 外泌體與其來源細胞具有相似生物學功能[6]，可作為介導細胞間通訊介質(zhì)。諸多研究表明，外泌體攜帶的蛋白、mRNA、miRNA在疾病發(fā)展過程中會有明顯變化，可作為疾病診斷的理想生物標記物[15]。有學者[16]發(fā)現(xiàn)肺癌和正常吸煙者血清外泌體中的miRNA有差異，miRNA-378a，miRNA-379，miRNA-139-5p，miRNA-200b-5p可作為區(qū)分肺癌和正常吸煙者的生物學標志。有學者[17]運用基因芯片及蛋白組學分別分析正常人與多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體（BM-MSC-exo）中miRNA水平，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤患者的BM-MSC-exo中miR-15a明顯下調(diào)，且IL-5、CCL2在明顯上調(diào)，這可能為骨髓瘤特異性標志物。

2 MSC-exo的作用機制

外泌體存在于諸多體液、細胞中，其中以MSC分泌能力為最強[18]。最初[19-21]，人們認為間MSC能募集到受損組織，自主分化替代受損細胞，達到自我更新作用。但隨著研究深入，在多種動物模型中發(fā)現(xiàn)[22-24]，MSC分化能力低，并非直接參與組織再生。有研究發(fā)現(xiàn)[25-26]，MSC培基上清液就能發(fā)揮修復受損組織損傷作用，這使得研究焦點集中于旁分泌機制，隨著研究深入進一步明確細胞間信息交流的紐帶是一種微型囊泡，即MSC-exo。MSC-exo不僅具備間充質(zhì)干細胞移植療效[27]，同時規(guī)避移植過程中堵塞、異常分化等風險，這使得MSC-exo相關(guān)研究日益增加[28]，其生物學作用機制逐步被揭示。

2.1 MSC-exo在炎癥中的作用 大量實驗研究表明，MSC具有抗炎作用。臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體（huMSCs-exo，huMSC-exo）中的 miR-181c可通過TLR4通路作用于巨噬細胞，降低燒傷大鼠體內(nèi)TNF-α，IL-1β水平，提高IL-10水平，進而緩解燒傷引起的炎癥反應(yīng)[29]。MSCs上清液可通過增強肺泡巨噬細胞中精氨酸酶1（arginase-1）水平及Ym1基因表達，降低促一氧化氮合成酶表達，進而促進肺泡巨噬細胞向M2分化，緩解脂多糖造成的肺損傷，表明其可能通過外泌體產(chǎn)生效應(yīng)[30]。MSC-exo在大鼠腎臟IRI中具有保護作用，IRI相關(guān)的組織凋亡和炎癥反應(yīng)在MSC-exo作用后都有明顯減輕，TNF-α和caspase-3可能是這一保護作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子[31]。還有研究表明[32]MSCs-exo可以通過抑制單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達進而緩解激光引起的視網(wǎng)膜炎癥損傷。

2.2 MSC-exo在氧化損傷中的作用 氧化損傷是許多疾病的發(fā)展過程中重要組成部分。病理情況下，細胞代謝產(chǎn)生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）不能被及時清除，ROS/RNS具有很高的反應(yīng)活性，能與細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)結(jié)合，對細胞結(jié)構(gòu)造成破壞。有研究表明[33]MSC-exo具有明顯的抗氧化能力。人hUMSC-exo可緩解CCL4引起肝衰竭小鼠肝臟ROS及氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-OHdG水平，體外實驗表明hUMSCs-exo可緩解CCL4與H2O2引起的肝細胞氧化損傷，這一作用可能與hUMSC-exo中的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX1）有關(guān)。在缺氧引起的肺動脈高壓模型中[34]，hUMSCs-exo可調(diào)節(jié) miRNA-17/miRNA-204平衡，影響STAT3信號通路，發(fā)揮保護作用。此外[35]，MSC-exo可活化抗氧化應(yīng)激信號通路Nrf2/ARE，抑制p38MAPK激活，降低半胱天冬酶3（Caspase 3）水平，緩解急性腎損傷中氧化損傷。

2.3 MSC-exo調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用 細胞凋亡是指細胞受到生理刺激發(fā)生的死亡，存在于多細胞的整個生命過程中。凋亡蛋白酶、銜接蛋白、Bcl-2和凋亡抑制蛋白（IAPs）是凋亡過程的重要分子，研究表明[36]，caspase-3介導的死亡受體通路是急性肝功能衰竭主要發(fā)病機制，hUMSC-exo可通過抑制caspase-3表達，進而發(fā)揮抗凋亡的作用。hUMSC-exo還能改善缺氧心肌細胞中Bax and Bcl-2蛋白水平，降低細胞凋亡水平，緩解心肌急性缺血性損傷[37]。還有研究發(fā)現(xiàn)[38]，小鼠BM-MSC-exo減少凋亡細胞的數(shù)量并降低caspase-3表達，改善心肌缺血及再灌注損傷。

2.4 MSC-exo影響組織細胞增殖的作用 MSC-exo還具有促進細胞增殖的作用。Akt在促進細胞增殖方面起重要作用[39]，Akt作用后的臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體能通過激活PDGF-D通路，促進心血管再生及心功能恢復。有學者[40]將EA.hy926細胞與hucMSC-Ex共培養(yǎng)，外泌體干預組有明顯優(yōu)勢，在急性心肌損傷模型中發(fā)揮促血管生成的作用。BMMSC-exo通過上調(diào)miR-17-92家族激活PTEN/mTOR信號通路速進細胞軸突生長[41]，也有研究發(fā)現(xiàn)[42]，MSC-外泌體還能夠增加神經(jīng)突分支數(shù)量和神經(jīng)突的總長度，這主要通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)細胞中的miR133b基因的表達來實現(xiàn)。

2.5 MSC-exo在腫瘤中的作用 近年來，經(jīng)研究人員不斷探索發(fā)現(xiàn)外泌體是MSC作用于腫瘤的關(guān)鍵中介因子，并通過傳遞生物學信息介導細胞與細胞之間交流。越來越多的證據(jù)表明MSC-exo參與腫瘤微血管的形成并促進腫瘤細胞的生長，如MSC-exo中可通過轉(zhuǎn)移miR-410促進體內(nèi)肺腺癌細胞增長[43]，在乳腺癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)[44]，BM-MSC-exo可通過活化ERK1/2信號通路上調(diào)VEGF表達從而促進腫瘤血管新生；相反，有學者認為[45]，MSC-exo通過miR-16調(diào)節(jié)VEGF表達，抑制癌癥組織血管新生，從而影響腫瘤進展，這可能與MSC來源、動物模型、腫瘤類型有關(guān)。

2.6 其他 此外，MSC-exo能發(fā)揮促進細胞分化作用，有學者[46]發(fā)現(xiàn)BM-MSC-exo能促進神經(jīng)元分化，miR-125b經(jīng)外泌體介導被靶細胞內(nèi)化后上調(diào)神經(jīng)元標志物并促進其形態(tài)生成。還有研究表明[47]，MSC-exo通過促進細胞遷移而促骨膠原成熟以及血管新生，在體外實驗中能通過促進成纖維母細胞和臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移、增殖，提高骨膠原Ⅰ，Ⅲ分泌及mRNA表達并呈劑量依賴性，這可能是MSC-exo發(fā)揮治療作用的機制之一。MSC-exo能下調(diào)腫瘤細胞VEGF水平表達[48]，主要是MSC-exo調(diào)節(jié)細胞因子分泌，改變細胞微環(huán)境，發(fā)揮旁分泌機制。最新研究表明[49]活化自吞噬功能也可能是外泌體作用機制之一，體外實驗中hucMSC-Ex能抑制腎小管上皮細胞的線粒體凋亡和炎性因子的釋放，增強自吞噬標記蛋白LC3B和自吞噬相關(guān)基因ATG5和ATG7在NRK-52E細胞中的表達，而抑制自噬時，作用消除，這表明，hucMSC-Ex可能通過自吞噬機制發(fā)揮作用。

3 中醫(yī)藥與外泌體

傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，中藥作用于MSC-exo的有關(guān)報道甚少，但是，傳統(tǒng)中藥對外泌體的作用已經(jīng)嶄露頭角。中醫(yī)中藥認為，紫草具有涼血、活血、解毒透疹功效，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，紫草的化學成分復雜，具有抗腫瘤、抗菌、抗生育、解熱、止血、降血糖等廣泛的藥理作用。紫草素是從傳統(tǒng)中藥紫草中提取的一種萘醌類物質(zhì)，并被證明有抗腫瘤活性。有研究表明[50]，腫瘤細胞來源的外泌體含miR-128能夠下調(diào)靶基因并促進細胞增殖，紫草素能通過減少腫瘤細胞來源外泌體抑制腫瘤細胞增殖。β-欖香烯是中藥莪術(shù)的有效成分，主要用于腫瘤的臨床治療。有學者[51]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可顯著抑制腫瘤細胞生長和誘導肺癌細胞凋亡，通過下調(diào)P53蛋白的表達促進腫瘤細胞外泌體的釋放達到抗人肺癌作用。還有研究表明[52]，中藥姜黃有效成分姜黃素通過雙向調(diào)節(jié)腫瘤細胞外泌體的蛋白和microRNA水平，改善內(nèi)皮屏障組織，減少血管生成表型，為腫瘤細胞微環(huán)境治療提供新方法。最新研究表明[53]，地黃有效成分梓醇能通過減少ERK1/2和PARP-1的激活有效降低氧化損傷引起的細胞凋亡及鈣離子內(nèi)流引起的髓鞘形成障礙，減少線粒體損傷，抑制活性氧過剩，從而預防或治療缺血性腦白質(zhì)損傷。

補陽還五湯為中醫(yī)傳統(tǒng)理血方劑，具有補氣、活血、通絡(luò)之功效，用于治療中風、冠心病等心血管疾病，臨床效果顯著，但機制尚不明確。越來越多的證據(jù)表明[54-56]補陽還五干預的MSC移植對缺血性梗塞具有良好治療作用，然而，補陽還五湯是否直接調(diào)節(jié)MSC的血管生成作用機制不清?；诖?，有學者表明[57]，補陽還五湯干預后的MSC-exo可激活內(nèi)皮細胞VEGF，上調(diào)miR-126的表達，抑制miR-221/222的表達，而抑制外泌體分泌后，上述作用減弱。此外，在缺血再灌注腦損傷大鼠模型中，補陽還五湯干預的MSC-exo可上調(diào)VEGF和Ki-67的表達，調(diào)節(jié)相應(yīng)miRNA，從而改善缺血癥狀，緩解腦缺血造成的組織損傷。

速效救心丸為含化滴丸，是中國用于心血管疾病治療的常用配方，主要成分有川芎、冰片等，具有行氣活血、祛瘀止痛的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明[58]，速效救心丸可擴張冠狀動脈、改善心肌缺血，具有顯著的心臟保護作用。選擇速效救心丸提取物體外干預心臟間充質(zhì)干細胞（C-MSCs），提取外泌體，研究結(jié)果表明[59]，速效救心丸可通過nSMase2通路刺激C-MSCs分泌外泌體，增強Rab27a、SYTL4和Rab27b蛋白表達水平，然而敲除Rab27b蛋白后，速效救心丸促進C-MSCs釋放外泌體作用消失，這表明速效救心丸通過nSMase2通路促進外泌體分泌而發(fā)揮保護心臟作用。進一步提取速效救心丸干預C-MSCs分泌的外泌體，并將提取的外泌體與心肌細胞（CMs）共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)[60]速效救心丸干預CMSCs后分泌的外泌體可顯著增強蛋白H3K27me3表達，顯著下調(diào)脫甲基化基因UTX表達。這表明，速效救心丸通過調(diào)控心臟C-MSCs外泌體功能，促進CMs染色體重塑以及增殖，發(fā)揮抗心肌損傷的作用。

4 小結(jié)與展望

越來越多的證據(jù)表明外泌體能介導細胞間和細胞內(nèi)的交流，不僅作為傳輸載體，也參與治療的多個過程。MSC-exo作為信息傳遞的“使者”，進行細胞與外界環(huán)境的交流，從而改變病灶微環(huán)境，影響疾病的發(fā)展。雖然許多學者對MSC-exo結(jié)構(gòu)、功能進行深入研究，但其在疾病治療中的作用機制尚未完全清楚，仍需進一步探索。中醫(yī)學理論體系的主要特點為整體觀念與辨證論治，中醫(yī)藥對MSC-exo作用相關(guān)研究較少，但中醫(yī)中藥作為一種理化因素，可能干預細胞MSC-exo數(shù)量或質(zhì)量，引起其功能的改變，通過多機制、多靶點對細胞、組織進行調(diào)控，從而發(fā)揮治療疾病的作用，這與中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論息息相關(guān)。外泌體具有其來源細胞的相似功能，這為中醫(yī)藥通過外泌體影響MSC從而發(fā)揮作用相關(guān)研究提供思路，那么，中藥是否通過影響外泌體發(fā)揮治療作用及其相關(guān)機制的研究可能成為未來研究趨勢。