細菌纖維素發(fā)酵生產的研究進展

劉 暢，薛靜雯

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211111；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023)

細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)是由不同微生物合成的纖維素總稱，為一種多孔網狀的納米級生物高分子聚合物。我國早在《齊民要術》就有記載食醋釀造過程中會在表面形成凝膠狀菌膜。后于1976年，英國科學家Brown在靜置培養(yǎng)木醋桿菌(Acetobacterxylinum，現(xiàn)名葡糖醋桿菌Glucoacetobacterxylinum)時，其表面形成一層白色凝膠狀薄膜，經物化分析確定該膜為纖維素類物質，而后對該物質進行水解，得到的主要成分為葡萄糖[1]。BC是多酶復合體系(纖維素合成酶，Cellulose synthase，CS)精確調控下的產物，僅由β-1，4-吡喃葡萄糖單體聚合的直鏈多糖，因此純度極高[2]。比起植物纖維素，BC還具有“上疏下密”狀三維網絡結構、高機械強度、高吸水率、高鎖水率、良好的生物相容性等特性，因此被廣泛應用于醫(yī)學、紡織、食品、細胞培養(yǎng)等多個領域[3-9]。BC應用前景十分廣闊，但目前BC發(fā)酵生產成本較高、產量略低，其產品的附加值低，故更大范圍的市場推廣受到了一定的制約。因此本文簡要論述了BC發(fā)酵生產的影響因素，為研究者們提供一些從菌種、發(fā)酵原料、發(fā)酵條件三方面對發(fā)酵工藝進一步優(yōu)化的可能性，以期擴大BC發(fā)酵生產規(guī)模并提高產量。

1 菌種選育

從源頭篩選高產且穩(wěn)定的菌株，對優(yōu)化BC發(fā)酵生產有直接效果。當前產BC菌株主要包括醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、產堿桿菌屬(Alcaligcncs)、八疊球菌屬(Sarcina)等，其中比較典型的是醋酸菌屬中的木醋桿菌，亦是迄今研究最為透徹的產纖維素菌。木醋桿菌是革蘭氏陰性菌，長1.0～4.0 μm，寬0.6～0.8 μm，常以單個、成對或鏈狀存在[12]。木醋桿菌在生長過程中可以利用多種底物，當菌體受到物理或化學損傷時，纖維素會對細胞起到一定的保護作用，因此木醋桿菌也是目前已知的菌株中產纖維素能力最強的。

產BC菌株可從發(fā)酵的飲品、腐爛的水果中被分離出來[13]，經過富集培養(yǎng)、初篩、復篩得到單一菌株。關于BC高產菌株的選育，很多學者運用自然選育、誘變育種、基因工程等方法進行了大量的工作。賈士儒等通過自然選育得到葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacteroxydans)B-2菌株，將BC產量提高到2 g/L[14]。馬承鑄等從150份自然材料分離出26株產纖維素菌株，自然選育后得到Ax-Ⅰ、Ac-Ⅱ兩株高產菌株，在50 g/L蔗糖(或葡萄糖)培養(yǎng)液條件下分別可產14 g/L、16 g/L纖維素[15]。余曉斌通過紫外誘變成選育BC高產菌株，將BC產量由6 g/L提高到10 g/L[16]。楊甲平對J2菌株進行超高壓處理得到誘變株M438，在相同發(fā)酵條件下M438的BC產量達到了15.7457 g/100 ml，是原菌株J2(10.76 g/100 ml)的1.485倍[17]。Carolina等克隆了(Gluconacetobacterhansenii) ATCC 23769 CS操縱子中的部分基因來探究在菌株中過表達這些基因對BC產量的影響，盡管結果尚不明確，但為日后的研究提供了一些新的思路[18-19]。Tonouchi等在木醋桿菌中表達了腸膜明串株菌(Leuconosocmesenteroides)的蔗糖磷酸酶(EC 2.4.1.7)基因，使木醋桿菌能更好的利用蔗糖，從而提高纖維素的產量[20]。在利用各種方法得到高產BC菌株后，還要對菌株進行遺傳穩(wěn)定性檢測，保證在傳代后目標性狀依然存在且不存在其他突變，完成檢測后斜面保存菌種。

2 發(fā)酵原料

產BC菌株為異養(yǎng)型，故在其生長過程中需添加能源物質。目前發(fā)酵產BC菌株常用的是HS培養(yǎng)基，由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏以及一些有機酸和無機鹽構成，HS培養(yǎng)基的BC產量為約1.757 g/L。Ramana在培養(yǎng)菌株時添加不同的培養(yǎng)基組分，發(fā)現(xiàn)不同的添加物對BC產量的影響不盡相同[19]。

2.1 碳源

BC發(fā)酵培養(yǎng)基碳源成分主要有葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖等。李玨等人在動態(tài)培養(yǎng)葡糖酸醋桿菌JR-02過程中，發(fā)現(xiàn)當碳源質量濃度為20 g/L時，果糖作為碳源的培養(yǎng)基中BC產量最高，其次是葡萄糖、甘露糖，而二糖作為碳源時BC產量明顯降低[21]。夏文等在此基礎上發(fā)現(xiàn)果糖作為碳源時BC產量高，是由于菌體中焦磷酸化酶和磷酸葡糖異構酶活性較高，依賴于磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸轉移酶系統(tǒng)可將D-果糖轉化為1-磷酸果糖，經兩步異構后變?yōu)?-磷酸葡糖，最終形成纖維素[22]。Ramana比較了甘露醇和葡萄糖對BC產量的影響，結果顯示添加甘露醇的培養(yǎng)基BC產量明顯高于添加葡萄糖的產量，因為甘露醇在菌體次級代謝中不會轉化為葡糖酸，能使菌體環(huán)境pH更加穩(wěn)定。趙瓊進一步探究了不同含量的甘露醇對BC產量的影響，發(fā)現(xiàn)添加10%的甘露醇BC產量最大[12]。此外，用混合糖做碳源也能提高BC產量。馬霞發(fā)酵時分別以20 g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖以及它們的兩兩混合物為碳源，其中以葡萄糖、果糖為碳源的BC產量分別為2.1 g/L、1.8 g/L，而以葡萄糖與果糖混合物為碳源的產量達到了2.55 g/L[22]。Premjet在不含葡萄糖的HS培養(yǎng)基中添加2.45%蔗糖和0.7%果糖，最終BC產量是HS標準培養(yǎng)基的179%[22]?；旌咸悄艽龠M多種糖代謝，使己糖磷酸能更多的用于合成纖維素，因此混合糖做碳源能夠提高BC產量。根據(jù)研究結果，果糖和甘露糖是大部分菌株的良好碳源，但這種純度高的碳源也相對昂貴，小型發(fā)酵或是實驗研究時建議選用這兩種為碳源，大規(guī)模工業(yè)化生產還是選用葡萄糖為宜。

2.2 氮源

用于BC生產的氮源物質主要有蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、玉米漿干粉、豆餅粉等。李玨在研究相同濃度(5 g/L)的不同氮源對BC產量的影響時，發(fā)現(xiàn)以玉米漿干粉為唯一氮源的培養(yǎng)基中BC產量最高(2.09 g/L)[22]。Jung等利用玉米漿為氮源生產BC，結果顯示與HS培養(yǎng)基相比BC產量從1.53 g/L提高到了3.12 g/L[25]。據(jù)報道玉米漿中的乳酸可轉化為丙酮酸并產生能量，丙酮酸可刺激三羧酸循環(huán)進而提高纖維素產量，此外玉米漿還可以幫助穩(wěn)定菌體環(huán)境的pH，并且相較于蛋白胨、酵母膏等氮源，玉米漿在價格上更具優(yōu)勢[18]。李飛等用玉米漿作氮源時BC產量達到9.2 g/L，但其成本只是對照組的15%[26]。除玉米漿外，趙瓊還以其他不同氮源進行發(fā)酵，結果大豆蛋白胨為氮源的產量最高，其次是牛肉膏和酵母膏，而以(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3這三種無機鹽為氮源的培養(yǎng)基中檢測不到任何纖維素[12]。此外，有研究指出以不同混合物為氮源，BC最終產量也呈現(xiàn)差異。程建軍在氮源總質量濃度為25g/L的條件下，將有機氮源蛋白胨和酵母浸粉等量混合后BC產量最大，達(4.22±0.08) g/L，顯著高于添加其它幾種氮源[27]。迄今對混合氮源的影響研究尚淺，需要更多的工作來確定最佳氮源混合物。根據(jù)當前的研究進展，玉米漿和蛋白胨是BC發(fā)酵的優(yōu)良氮源，作為工業(yè)化生產更推薦價格低廉的玉米漿。

2.3 添加物

在培養(yǎng)基中添加一些除碳源、氮源外的物質，對保證發(fā)酵的持續(xù)高效進行有不可忽視的作用，這類物質主要是無機鹽如鉀鹽、磷鹽、鈉鹽和有機酸如醋酸、乳酸、檸檬酸、丙酮酸等，某些菌種還可選擇性的加入低聚糖、維生素、醇類等物質。大部分添加物的作用機理是增加培養(yǎng)基粘度從而降低剪切力的作用，或是抑制葡糖酸的形成，亦或是改變細胞狀態(tài)，最終達到提高產量的目的。李玨等人在培養(yǎng)基中添加低濃度的Na2HPO4、MgSO4、CaCO3，結果BC產量都不同程度的提高[18]。Mg2+和Ca2+是菌類生長的所需元素，可作為多種酶的輔基或激活劑，故添加適量濃度Mg2+和Ca2+可促進BC生產。Na2HPO4能夠對培養(yǎng)基pH起緩沖作用，因此提高BC產量，但是添加低濃度的KH2PO4對BC合成沒有顯著影響，當KH2PO4達到一定濃度后反而會對BC合成產生抑制作用[27]。Song在基礎培養(yǎng)基中加入0.4%的瓊脂，最終BC產量提高了10%[22]。維生素C與BC間的親和力較高，Kesh在HS培養(yǎng)基中加入維生素C，最終BC產量提高而結晶度下降了[22]。此外還有多篇文獻報道乙醇對大部分合成纖維素的菌株都有增產效應，這種增產效應是由于大部分菌株能將乙醇轉化為乙酸，進而轉化為二氧化碳和水，以此提高ATP的水平，促進纖維素合成。Takaaki等在研究中發(fā)現(xiàn)加入濃度低于15 g/L的乙醇可以提高BC合成速率和總產量，但是超出這個量便會抑制BC合成[28]。但是不同菌株對乙醇的這種增產效應呈現(xiàn)出差異性反應，如木醋桿菌NLQ127就不同于大多數(shù)菌株，乙醇對NLQ127菌株不存在增產效應[28]，所以不同的菌株都需要測試其對乙醇的敏感性和耐受性，明確該菌株是否適宜添加乙醇，如果適合再確定最佳濃度。還有研究者添加榴蓮殼水解產物[29]、釀酒廠污水[30]、多糖發(fā)酵廢水[31]等物質用以發(fā)酵產BC菌株，最終前兩者的BC產量都顯著提高了，分別達到2.67 g/L、8.5 g/L，而多糖發(fā)酵廢水中的BC產量下降到了1.177 g/L。

不同發(fā)酵原料對不同菌種會產生差異性影響，因此建議在正式發(fā)酵生產前先進行小型發(fā)酵試驗，確定最佳添加物及其最適濃度，綜合考量增產效益和經濟效益后確定發(fā)酵原料。

3 發(fā)酵條件

3.1 pH

pH會改變細胞膜的電荷以及菌體環(huán)境的離子強度，進而影響B(tài)C的產量和形態(tài)。Satoshi等對初始pH為2.5～7.7間的不同培養(yǎng)基的BC產量進行比較，發(fā)現(xiàn)當pH為4.0～6.0時BC產量明顯高于其他pH值下的產量[25]。趙瓊研究木醋桿菌突變株C544時，發(fā)現(xiàn)pH為6.0時纖維素產量最高，而當pH低于5.0或超過7.5時產量就極小，達到8.5后就沒有纖維素產生了[12]。Jagannath等以椰子水為原料靜態(tài)發(fā)酵菌株，當初始pH為3.5時培養(yǎng)20d也無明顯BC膜出現(xiàn)，而初始pH為4.0時，短時間內就可以觀察到明顯的BC膜。王雪奇等從黃酒和紅茶菌中篩選得到兩株產BC菌株，分別在最適pH(4～5、5～6)下培養(yǎng)BC產量分別達到了2.0和1.7 g/L[34]。除了考慮初始pH對產量的影響，還要培養(yǎng)基組分在發(fā)酵過程中對pH的影響，例如用椰子水發(fā)酵的培養(yǎng)基pH變化就比較小，因為椰子水緩沖容量大，而用其他漿水發(fā)酵的pH變化幅度就相對大一些[35]。又如以葡萄糖為碳源時，菌體會將葡萄糖轉化為葡糖酸，造成發(fā)酵環(huán)境的pH降低，從而BC產量減少，若是加入乙酸可以減弱這種轉化能力，更有利于BC合成。綜上來看，BC發(fā)酵生產的初始pH在6.0左右最為適宜，但還要考慮培養(yǎng)基組分在發(fā)酵過程中對pH的影響，pH越穩(wěn)定的培養(yǎng)基組分越適于發(fā)酵。

3.2 溫度

溫度會影響菌體的生長發(fā)育和代謝物生成。Fontnaa等人比較了發(fā)酵溫度為22～34℃間醋酸桿菌BC的產量，發(fā)現(xiàn)在此溫度范圍內產量隨溫度上升而提高，但超過34℃菌株就無法正常生長，更無法形成BC[27]。趙瓊在研究木醋桿菌突變株C544時結果顯示該突變株在25～31℃生長旺盛，30℃時產量最高為2.21 g/L，超過32℃ BC產量驟降，此外他還發(fā)現(xiàn)C544有一定的耐低溫性，在19℃時還可以產BC[12]。朱宏陽等動態(tài)培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)當溫度為32℃時BC產量最高，并且此時產生的BC顆粒直徑和均勻度最佳[36]。大部分菌株的最適溫度都為28～30℃，超過30℃時BC產量便開始下降，因此BC發(fā)酵生產中常選用30℃為最適溫度。

3.3 接種量

接種量會影響菌種在發(fā)酵過程中的生長速度，適宜的接種量范圍內菌株能快速生長，代謝產物也會快速合成，并且菌株生長速度隨接種量的增加而提高，超過適宜范圍后菌株就會因生長速度過快而減少BC合成。湯衛(wèi)華等以硅膠管為發(fā)酵容器，分別接種2%、4%、6%、8%(v/v)的木葡糖醋酸桿菌(Gluconacetobacterxylinum)，在30℃下培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)接種量為4%(v/v)的硅膠管中的BC產量最高[37]。許燕娜等采用HMF培養(yǎng)基對木醋桿菌CGMCC5173菌株進行實驗，結果表明當接種量為10%時BC產量最高，達到了14.79 g/L[38]。朱宏陽等對解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)ZF7菌株進行接種量測試，發(fā)現(xiàn)當接種量為5%時BC產量最高，接種量在9%以下時BC顆粒和直徑呈現(xiàn)比較均勻[36]。不同菌株以及不同的培養(yǎng)基組分都影響最適接種量，大部分菌株都適用于5%的接種量，通過預實驗可以更精準的確定最適接種量。

3.4 發(fā)酵時間

不同的發(fā)酵時間可以顯著影響B(tài)C合成情況，如產量和顆粒形態(tài)。通常的發(fā)酵情況下當發(fā)酵時間不斷延長，纖維素會逐漸由短絲狀變?yōu)榧殘F狀，5 d后BC顆粒趨于穩(wěn)定，此時檢測培養(yǎng)基成分可以檢測到葡萄糖基本耗完[38]。觀察菌株的動力曲線可以發(fā)現(xiàn)，一般發(fā)酵2 d后進入對數(shù)生長期，7 d進入穩(wěn)定期，此后BC產量趨于平緩。此外，王艷梅等在用椰子水進行預發(fā)酵實驗時發(fā)現(xiàn)進行預發(fā)酵1～2 d能顯著提高BC產量[39]。所以在BC發(fā)酵生產中可以嘗試先進行兩天預發(fā)酵，再正常發(fā)酵5～7d，這樣BC產量可達到最大化。

3.5 轉速

在進行動態(tài)培養(yǎng)時，搖床轉速也是一大影響因素。朱宏陽等人對比了靜態(tài)培養(yǎng)和不同轉速下動態(tài)培養(yǎng)的BC產量，發(fā)現(xiàn)當轉速到達200 r/min時，BC就更容易與絮狀物形成顆粒團，200 r/min以下時轉速越大BC顆粒就越大且數(shù)量越多。研究表明小瓶動態(tài)培養(yǎng)下BC產量普遍低于比靜態(tài)培養(yǎng)下的產量，因為動態(tài)培養(yǎng)時氧氣充足但能源物質得不到補充，菌體生長旺盛呼吸作用強烈，同時碳源消耗較多，從而減少了BC合成[36]。李玨等指出當轉速取160 r/min時，大部分菌種能達到最高產量，但隨著轉速的進一步提升，BC產量反而會下降，因為高轉速會提高剪切力破環(huán)纖維素的合成[18]。因此動態(tài)培養(yǎng)時轉速取160～200 r/min為宜，具體可視發(fā)酵裝置大小而定。

4 結論與討論

細菌纖維素近年來作為一種新興的生物材料，被廣泛應用于眾多領域，具有良好的發(fā)展前景。盡管其發(fā)酵過程相對簡單，但是目前工業(yè)化生產尚在初級階段，因此提升產BC菌發(fā)酵工藝成為急需解決的問題。不同菌種有各自的最適發(fā)酵原料、最適條件，本文論述的只是大部分菌種的適用范圍。針對特定菌種的發(fā)酵生產，研究者們需要做進一步優(yōu)化設計，在單因素實驗的基礎上，選取不同因素進行PlackettBurman(PB)試驗或是BoxBehnken(BB)試驗，通過響應面分析來確定最佳發(fā)酵模式。陳海超等人在研究漢遜氏葡糖酸醋桿菌(G.hansenii)用正交實驗總結出當培養(yǎng)基組成為(g/L)：蔗糖10、酵母粉9.36、蛋白胨5、檸檬酸0.3、磷酸氫二鈉2.86、初始pH為5.96、接種量為10%、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為10 d時，BC產量最高[40]。朱宏陽等針對芽孢桿菌ZF7的最佳條件設定為接種量為5%、150 r/min、32℃ 振蕩培養(yǎng)5 d[36]。當前細菌纖維素發(fā)酵生產已有一定進展，但尚有較大的提升空間，為了細菌纖維素的大規(guī)模推廣，研究者們需要探究菌種選育、發(fā)酵原料、發(fā)酵條件以及更多潛在影響因素，從產量、成本和環(huán)境安全等多個方面綜合考量，注重BC產量同時也要注重產品性能，以利于細菌纖維素更好更達的利用與推廣。