乳酸菌胞外多糖的分類及生物活性研究進(jìn)展

文/黃承敏 陳 綺 游善兵 姚 慧 肖 茜 劉成國(guó) 周 輝＊

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院；2 湖南南山牧業(yè)有限公司）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是能夠利用可發(fā)酵糖，產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱。作為公認(rèn)安全的益生菌，LAB可促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)，對(duì)腹瀉、腸易激綜合征、過(guò)敏、乳糖不耐受、刺激反應(yīng)等均有一定的治療功效[1]，因而在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。許多LAB的益生作用與其所產(chǎn)生的胞外多糖關(guān)系密切。胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）是一些特殊微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外、滲透到培養(yǎng)基中、易與菌體分離的一類多糖類化合物，對(duì)微生物的生長(zhǎng)有著重要意義[2]。許多LAB的益生作用與其產(chǎn)生的EPS關(guān)系密切。

1 乳酸菌胞外多糖的分類

根據(jù)存在位置的不同，LAB EPS可以分為莢膜多糖和粘多糖兩類，但這兩類多糖結(jié)合在一起很難區(qū)分[3，4]。根據(jù)化學(xué)組成的不同，LAB EPS可分為同型多糖和雜多糖兩類。同型多糖是由1 種單糖組合而成的EPS，雜多糖則是由多種單糖組成的3～8 個(gè)重復(fù)單元所構(gòu)成。大多數(shù)LAB所產(chǎn)生的EPS都是雜多糖，但在過(guò)去10 年，同型多糖卻是研究最為廣泛的一類EPS[5，6]。

2 LAB EPS的化學(xué)組成

EPS的主要組成成分是碳水化合物和蛋白質(zhì)，也有一些EPS中還含有脂類、核酸或一些無(wú)機(jī)成分，這與EPS的分離純化方法和菌株的來(lái)源密不可分[7]。

同型多糖僅由1 種單糖聚合而成，故其組成成分較雜多糖更為簡(jiǎn)單。同型多糖之間的差異主要體現(xiàn)在主鏈連鍵、分子量和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)等一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同，平均分子量通常在1.0×107Da左右。葡聚糖和果聚糖是其中最常見(jiàn)的兩種成分，通常由一個(gè)主鏈和不同分支度的支鏈構(gòu)成。根據(jù)碳元素結(jié)合位點(diǎn)的不同，同型多糖可以分為α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖和β-D-果聚糖三種類型[8，9]。

與同型多糖相比，雜多糖的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)則更為復(fù)雜，產(chǎn)量也更低。雜多糖的生物合成是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，分子量在1.0×104～1.0×106Da之間。線性或支鏈的單元組成了雜多糖，而這些基本的重復(fù)單元又是不同的單糖在酶的作用下通過(guò)α或β-糖苷鍵連接組成，如半乳糖、鼠李糖或葡萄糖。雜多糖有時(shí)會(huì)混有N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或葡糖醛酸，甚至還可能存在磷酸基、乙?；透视偷绕渌菤埢鵞10，11]。EPS的結(jié)構(gòu)與其功能有著密不可分的聯(lián)系，分子量、重復(fù)單元和單糖組成、糖苷鍵連接類型、化學(xué)基團(tuán)等因素是影響其功能的關(guān)鍵因素[12]，但對(duì)于何種結(jié)構(gòu)決定何種功能則研究較少。

3 LAB EPS的生物活性

目前已有研究報(bào)道，LAB所產(chǎn)EPS具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性。

3.1 抗腫瘤活性

腫瘤的發(fā)生會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)復(fù)雜、多階段的過(guò)程，遺傳因素和機(jī)體自身免疫功能低下是其發(fā)生的主要原因。1982年Shiomi等[13]研究發(fā)現(xiàn)EPS具有抑制腫瘤活性后，就成為了眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

Oda等[14]研究表明，瑞士乳桿菌約古特亞種所產(chǎn)EPS具有抗腫瘤活性，其腫瘤抑制的主要機(jī)制是通過(guò)宿主介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而實(shí)現(xiàn)的。Vinderola等[15]發(fā)現(xiàn)馬乳酒樣乳桿菌具有抗菌、促進(jìn)傷口愈合和抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。Lee等[16]經(jīng)過(guò)對(duì)雙歧桿菌丁醇提取物進(jìn)行抗腫瘤活性分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自于青少年雙歧乳桿菌的肽聚糖、多糖片段和糖蛋白都具有腫瘤抑制作用，突出表現(xiàn)在對(duì)結(jié)、直腸癌的預(yù)防作用。 Ruas-Madiedo等[17]在研究乳酸乳桿菌乳油亞種KVS20的抗腫瘤活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，向荷肉瘤小鼠S180腹腔中注入含有該菌EPS的菌體凍干物后，產(chǎn)生了抗癌效果，但只注射菌體則沒(méi)有此效果。

劉宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌保加利亞亞種OLL1073R-1所產(chǎn)EPS不但具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群組成、抗高血壓、降膽固醇等生理作用，還可以調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤活性。邢書(shū)涵等[19]從藏靈菇中篩選出了一株產(chǎn)EPS的干酪乳桿菌KL1，將其所產(chǎn)EPS進(jìn)行純化后研究其對(duì)HCT-8人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果表明，純化后得到的單一組分EPSa具有阻礙HCT-8細(xì)胞增殖的作用，且細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。對(duì)細(xì)胞凋亡情況的探究發(fā)現(xiàn)，EPSa處理組的凋亡細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，由此判斷，藏靈菇源干酪乳桿菌KL1菌株所產(chǎn)單一多糖EPSa可誘導(dǎo)HCT-8發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而阻礙HCT-8細(xì)胞的增殖。

惡性腫瘤醫(yī)治的慣用有效方法為手術(shù)、放療、化療等，但這些手段往往在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，還會(huì)對(duì)人體的正常組織產(chǎn)生毒性，造成許多嚴(yán)重的副作用。減少機(jī)體毒副作用、保護(hù)機(jī)體的正常免疫功能和殺傷腫瘤細(xì)胞在腫瘤疾病治療過(guò)程中具有同等重要的意義[20]。藥理及臨床試驗(yàn)證明，EPS是一種可以作為免疫調(diào)節(jié)劑的化合物，能激活機(jī)體自身的免疫功能，且EPS自身具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等特點(diǎn)，使其應(yīng)用于癌癥的輔助治療中，為腫瘤的治療提供了更安全的手段[21]。

3.2 抗氧化活性

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的形成和惡性轉(zhuǎn)移與過(guò)氧化緊密相關(guān)，所以EPS的抗氧化活性與腫瘤抑制活性也有著十分密切的聯(lián)系。具有高水平抗氧化作用的EPS一般也具有一定的腫瘤抑制活性，這或許是由于決定EPS抗氧化活性的特定結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)相似而產(chǎn)生的[22，23]。Kanmani等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌PI80代謝產(chǎn)生的EPS在體外對(duì)羥自由基和超氧化由基具有較強(qiáng)的清除能力。Xu等[25]對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH（Bifidobacteriumanimalis RH）所產(chǎn)EPS進(jìn)行分離純化，得到一種重要的EPS組分EPSa，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)EPSa片段濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除能力與0.25 mg/mL的維生素C（VC）相當(dāng)；且EPSa對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制活性、對(duì)羥自由基（OH）及超氧陰離子自由基（O2-）的清除能力都明顯高于VC。

顏炳祥等[26]研究了硒化EPS的抗氧化能力，結(jié)果表明，硒化的EPS總抗氧化能力及對(duì)OH的清除活性較強(qiáng)，但對(duì)O2-的清除活性與未硒化的EPS相比，變化相差不大。熊強(qiáng)等[27]研究表明，來(lái)自植物乳桿菌Z22酸性多糖EPS-S和中性多糖EPS-Z都具有較好的自由基清除活性。其中EPS-S對(duì)DPPH的清除能力為27.75%，對(duì)OH的清除能力為66.16%、對(duì)O2-的清除能力達(dá)58.00%；而EPS-Z對(duì)這3 種自由基的清除率分別為24.02%、59.03%和45.20%，結(jié)果表明，酸性多糖比中性多糖具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

蔡秋杏等[28]研究了腌干魚(yú)來(lái)源的LAB，發(fā)現(xiàn)LAB菌株的抗氧化能力越強(qiáng)，其在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性也越高，同時(shí)該菌株EPS產(chǎn)量、純度也更高，抗氧化能力也更強(qiáng)。劉雯雯等[29]在研究植物乳桿菌-12所產(chǎn)EPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制效果隨著EPS濃度的增加而增大；在植物乳桿菌-12 EPS的抗氧化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DPPH清除率與EPS濃度呈依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DPPH清除率能達(dá)到49.13%；在細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中，EPS濃度為500 μg/mL時(shí)，HT-29細(xì)胞凋亡數(shù)可達(dá)50.3 個(gè)。

3.3 免疫調(diào)節(jié)活性

大量研究表明，EPS具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠提高T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，并激活巨噬細(xì)胞的吞噬能力等[30]。然而并不是所有的EPS都具有免疫活化功能，其免疫活性因LAB菌株屬性的不同而有所差異，這種差異對(duì)活性EPS的結(jié)構(gòu)也有影響。EPS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)系主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，含有負(fù)電荷側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的酸性雜多糖對(duì)免疫反應(yīng)有很好的誘導(dǎo)作用；其次，體積或分子量大的雜多糖會(huì)抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生[31]。例如，酸性LABEPS的組成中含有磷酸根基團(tuán)，所以大多能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；敲除了EPS合成基因后，EPS較高分子量的天然EPS能夠更加有效的誘導(dǎo)TNF-α、IL-12、IL-10和IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[32]。

李偉欣等[33]研究了一種雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的EPS的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示，低劑量的EPS可以誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，并顯著提高小鼠血清半數(shù)溶血值HC50，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬能力，表明此雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的EPS對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的特異性和非特異性免疫都有增強(qiáng)效果，具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。Ruas-Madiedo等[34]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物雙歧桿菌亞種（B. animalis ssp.）lactis A1、IPLA-R1、長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum）、NB667和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus GG）的EPS在1 mg/mL時(shí)能夠抵御體外真核細(xì)胞的細(xì)胞毒素，保護(hù)人體不受病原菌侵害。Kitazawa等[35]研究表明，分離自雙歧桿菌發(fā)酵液的EPS表現(xiàn)出較高的淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答促進(jìn)作用；保加利亞乳桿菌OLL1073R代謝產(chǎn)生的酸性EPS可以促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞的有絲分裂。

4 展望

LAB作為發(fā)酵食品中常見(jiàn)的微生物，一直是食品微生物方向的研究熱點(diǎn)。隨著大量的LAB EPS被分離和鑒定，其生物活性不斷被揭示，在未來(lái)將會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。目前困擾LAB EPS開(kāi)發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題是如何提高其產(chǎn)量，更好地降低EPS的生產(chǎn)成本。例如，采用一些物理、化學(xué)的誘變方法來(lái)篩選高產(chǎn)的突變體，增加EPS的產(chǎn)量。此外，基于對(duì)LAB EPS生物合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)EPS的工程菌株，也是促進(jìn)EPS工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的有力手段。另一方面，LABEPS的組成存在很大的差異性，即使同一種LAB，其代謝產(chǎn)生的EPS也存在菌株特異性。未來(lái)需要建立EPS組成與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系，用于EPS的人工設(shè)計(jì)，更好地促進(jìn)LAB EPS在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。