常用實驗室技術(shù)診斷結(jié)核性腦膜炎效能的比較研究

鄭會強 崔曉利 竇權(quán)利 康磊 李愛芳 楊翰 劉元 談小文 黨麗云

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)在結(jié)核病中占0.5%～1.0%[1],由結(jié)核分枝桿菌(MTB)經(jīng)血液循環(huán)侵入顱內(nèi)或經(jīng)其他途徑播散至顱內(nèi)而引起的腦膜、脊膜、腦實質(zhì)、腦血管等的慢性非化膿性炎癥，其發(fā)病隱匿，缺乏快速、敏感的診斷方法，導致診斷治療不及時,因而死亡及致殘的發(fā)生率較高。

MTB具有抗酸性、多形性、抵抗力強、菌體結(jié)構(gòu)復雜和生長緩慢等特殊的生物學特性[2]，致使TBM的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，腦脊液、血液等指標變化不明顯，病原學檢查敏感度不高，難以與病毒性、化膿性、隱球菌性等腦膜炎相鑒別。目前診斷TBM主要依賴于臨床癥狀、影像學表現(xiàn)、腦脊液生化、腦脊液常規(guī)、腦脊液培養(yǎng)、抗酸染色、分子生物學，以及免疫學檢查等。筆者回顧性分析BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)、改良抗酸染色(簡稱“MZN法”)、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert法”)、熒光探針法聚合酶鏈式反應(簡稱“PCR-熒光探針法”)和結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)等5種實驗室檢測技術(shù)對西安市胸科醫(yī)院TBM疑似患者腦脊液進行檢測的結(jié)果，探討以上5種方法在TBM早期診斷中的價值。

對象和方法

一、 研究對象

回顧性分析西安市胸科醫(yī)院2017年1月至2018年4月期間收治的成年疑似結(jié)核性腦膜炎患者244例，以2010年國際TBM協(xié)作組制定[3]的評分標準(臨床評分≥6分)為診斷標準(表1)，最終篩選出104例患者，患者腦脊液均進行上述5種技術(shù)檢測。104例患者分為4組：(1)確診組(36例)：符合臨床癥狀和體征，進行腦脊液抗酸染色檢查出抗酸桿菌，或者進行腦脊液MTB培養(yǎng)陽性或核酸檢測陽性；(2)很有可能組(23例)：符合臨床癥狀和體征，同時臨床評分≥10分(無神經(jīng)影像學表現(xiàn))或臨床評分≥10分(伴有神經(jīng)影像學表現(xiàn))；(3)可能組(12例)：符合臨床癥狀和體征，臨床評分6～9分(無神經(jīng)影像學表現(xiàn))或臨床評分6～11分(伴有神經(jīng)影像學表現(xiàn))；(4)非TBM組(33例)：不符合國際TBM組制定的評分標準(臨床評分<6分)。本研究獲得本院倫理委員會的批準，4組患者均簽署知情同意書。

確診組、很有可能組和可能組共71例，作為TBM組；其中，男39例，女32例；年齡18～74歲，平均(34.1±19.2)歲。非TBM組33例患者，包括臨床評分<6分的疑似結(jié)核性腦膜炎患者18例、化膿性腦膜炎6例、病毒性腦膜炎4例、隱球菌性腦膜炎5例。

二、實驗室方法

1. MGIT 960法[4]:儀器為BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD醫(yī)療器械有限公司)，試劑為MGIT液體培養(yǎng)管(美國BD醫(yī)療器械有限公司，批號為6140573)，分枝桿菌培養(yǎng)添加劑(美國BD醫(yī)療器械有限公司，批號為6293546)等。參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》取患者0.5 ml腦脊液接種于加有分枝桿菌培養(yǎng)添加劑的液體培養(yǎng)管中，同時按同樣方法接種0.5 ml 1麥氏單位標準菌株(H37Rv)稀釋100倍后的稀釋菌液(質(zhì)控樣本,6～10 d顯示陽性結(jié)果則質(zhì)控合格)，混勻后放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)，儀器培養(yǎng)報陽后取培養(yǎng)后的菌液行萋-尼抗酸染色，確認是否為抗酸桿菌，然后行MTB抗原檢測(MPB64蛋白抗原；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)。

2. MZN法[5]：儀器為BX43醫(yī)用光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)MV-6微型細胞玻片離心沉淀器，試劑為BASO結(jié)核菌染色液(冷染法)(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號為417021)。取患者0.5 ml腦脊液、H37Rv(陽性質(zhì)控)和已知健康人群痰液(陰性質(zhì)控)分別加入FMV-6微型細胞玻片離心沉淀器的沉淀管中，50×g離心3 min，保證腦脊液標本中的有形成分完全沉淀至掛膠玻片上；然后將微型細胞玻片浸于甲醛丙酮固定液中30 s；再將固定后的玻片浸泡于0.3% Triton X-100破膜液中30 min，后用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液洗3次；最后行抗酸染色，顯微鏡下判斷是否存在抗酸桿菌。

表1 結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷評分

3.GeneXpert 法[6]：儀器為GeneXpert MTB/RIF分析儀(美國Cepheid公司)，配套試劑為GeneXpert法檢測試劑盒(美國Cepheid公司，批號為1000032621)。取患者1 ml腦脊液按試劑盒說明書操作進行標本前處理，然后上機檢測，得出結(jié)果[循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)小于40結(jié)果判定為陽性]。同時根據(jù)試劑盒說明書要求，做樣本處理質(zhì)控和探針質(zhì)控。

4.PCR-熒光探針法[7]：儀器為ABI 7500熒光PCR檢測系統(tǒng)(美國應用生物公司)，配套試劑為分枝桿菌核酸檢測試劑盒(北京博奧生物科技有限公司，批號為0112161708和0105171801)。取患者1 ml 腦脊液和已知健康人群痰液(陰性質(zhì)控)按試劑盒說明書要求進行標本前處理，同時取0.5麥氏單位H37Rv菌懸液提取核酸調(diào)至1×1010IU/ml作為陽性質(zhì)控，然后上機檢測，擴增曲線呈S型且Ct值小于40結(jié)果判定為陽性。

5. T-SPOT.TB[8]：儀器為BX43醫(yī)用光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，試劑為T-SPOT.TB檢測試劑盒(免疫斑點法)(英國牛津公司，批號為TEC208772和TEC333862)。取患者4 ml腦脊液按試劑盒說明書要求進行前處理，同時按試劑盒說明書要求處理陽性對照質(zhì)控(斑點數(shù)超過20個為試驗合格)，然后得到保證細胞數(shù)量為2.5×106個/ml的標準溶液，上機孵育后斑點計數(shù)，得出結(jié)果(陽性判斷標準：(1)空白對照孔斑點數(shù)為0～5個時，且A孔或B孔與空白孔的斑點數(shù)的差值≥6；(2)空白對照孔斑點數(shù)為6～10個時，且A孔或B孔斑點數(shù)≥兩倍空白孔斑點數(shù))。

將MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-熒光探針法和T-SPOT.TB等5種實驗室技術(shù)分為4個組，A組為細菌學方法組，包括MGIT 960法和MZN法；B組為分子生物學方法組，包括GeneXpert法和PCR-熒光探針法；C組為免疫學方法組，包括T-SPOT.TB；D組為聯(lián)合診斷組，包括以上5種試驗；綜合比較5種實驗室技術(shù)診斷TBM敏感度和4種方法組診斷TBM敏感度的差異。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以“率(%)”表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 實驗室檢查基本情況

均行MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-熒光探針法和T-SPOT.TB檢測的71例患者中，MGIT 960法陽性14例，陰性57例；MZN法陽性19例，陰性52例；GeneXpert法陽性30例，陰性41例；PCR-熒光探針法陽性25例，陰性46例；T-SPOT.TB陽性21例，陰性50例。

以臨床診斷為標準，GeneXpert法和PCR-熒光探針法的敏感度高于MGIT 960法，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=8.43，P=0.004；χ2=4.28，P=0.039)；MZN法和T-SPOT.TB試驗的敏感度與MGIT 960法比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.99，P=0.320；χ2=1.85，P=0.242)，見表2。

二、 不同方法組間檢測效能的比較

以臨床診斷為標準，細菌學方法組、分子生物學方法組、免疫學方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度分別為31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。見表3。分子生物學方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度高于細菌學方法組，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=5.71，P=0.017；χ2=73.20，P=0.000)。

討 論

TBM是最常見的肺外結(jié)核之一，占肺外結(jié)核的5%～10%[9]。TBM患者死亡率高，多發(fā)生在發(fā)病初6個月，病死率可達26.8%[10]，因此早期快速的實驗室診斷方法能夠為患者的治療和預后提供較大幫助。目前關(guān)于TBM早期快速診斷的實驗室方法研究較多，各研究者對細菌學、免疫學、分子生物學等方法的報道不盡相同。

本研究MGIT 960法檢測的敏感度為19.7%，Rajeev 等[11]報道MTB培養(yǎng)敏感度為10%～30%，Philip等[12]報道MTB培養(yǎng)敏感度為10%～71%，由此可見，MTB培養(yǎng)敏感度差異較大。本研究考慮到MGIT 960法液體培養(yǎng)陽性只能說明是分枝桿菌復合群，也可能存在非結(jié)核分枝桿菌，因此用培養(yǎng)陽性后的菌液做MTB抗原檢測試驗，確認其為結(jié)核分枝桿菌復合群。但是MGIT 960法培養(yǎng)周期長，不能滿足TBM的早期快速診斷。腦脊液涂片Z-N法檢測的敏感度低，只有10%左右，并且只能檢測到細胞外抗酸桿菌[13]，吳海峰[14]報道抗結(jié)核藥物作用于MTB細胞壁，導致部分MTB的L型(MTB-L)出現(xiàn)，其細胞壁不完整，抗酸染色時細菌體不易著色，或者著色極淡，進而使得抗酸桿菌的檢出率降低。因此本研究采用改良抗酸染色法(MZN法)[5]，將患者腦脊液離心、固定、破膜后行抗酸染色，然后顯微鏡下找抗酸桿菌，最終敏感度為26.8%。此方法能檢測細胞內(nèi)和細胞外的抗酸桿菌，且可在患者接受治療6.5個月后檢出[15-16]，因此MZN法敏感度明顯高于Trusov 等[17]報道的傳統(tǒng)抗酸染色(Z-N法)10%左右。但是腦脊液抗酸染色是在顯微鏡下找抗酸陽性桿菌，并不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌，且容易受到標本采集、抗結(jié)核藥物和實驗者主觀因素的影響。可見，雖然MZN法敏感度明顯高于Z-N法，但仍然不能滿足臨床需求。

表2 以臨床診斷為標準5種實驗室檢測技術(shù)檢測104例患者腦脊液的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 以臨床診斷為標準4種方法組檢測104例患者的敏感度

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

分子生物學方法近年來成為研究熱點，2017年新版肺結(jié)核診斷標準(《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》)[18]中推薦分枝桿菌核酸檢測為結(jié)核病診斷的參考標準之一。本研究采用PCR-熒光探針法，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入熒光探針，把核酸擴增、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，保證整個過程在單管中進行，最大限度地降低了PCR產(chǎn)物對實驗的污染[19]。最終得出PCR-熒光探針法在TBM診斷中的敏感度為35.2%，高于MGIT 960法的19.7%。Hannan 等[20]報道PCR在MTB的DNA檢測中的敏感度為31%～100%，特異度為66%～100%，由于單一的靶基因擴增，某些TBM患者中可能沒有這些基因，此外MTB的細胞壁有一個不透水的復雜結(jié)構(gòu)使細胞溶解困難，從而導致核酸含量低，這些因素均可能導致一定的假陰性，因此單一的PCR-熒光探針法試驗在TBM的診斷中也存在很多缺點。WHO推薦GeneXpert法檢測作為TBM初次檢測的優(yōu)先方案，該方法在TBM的早期診斷中有巨大優(yōu)勢[21-22]。近年來，國內(nèi)外對GeneXpert法新型分子診斷平臺在肺結(jié)核、肺外結(jié)核、耐藥結(jié)核病，以及結(jié)核病并發(fā)HIV感染等疾病中的研究層出不窮。本研究采用GeneXpert法檢測的敏感度達42.3%，明顯高于MGIT 960法，且與楊元利等[23]報道的采用GeneXpert法在TBM患者腦脊液檢測中的敏感度(41%)差距不大，與劉銳等[24]報道GeneXpert法檢測TBM的敏感度(43.1%)相差較小。由此可見，GeneXpert法診斷的敏感度優(yōu)于MGIT 960法，其快速、準確的優(yōu)點對TBM的早期診斷、治療和預后幫助很大；同時其可以檢測利福平耐藥情況。因此，GeneXpert法比較適合在結(jié)核病高負擔國家推廣使用。由于GeneXpert法僅憑單一的靶基因擴增和檢測單一的rpoB基因耐藥決定區(qū)，可能導致產(chǎn)生一定的假陰性，其在TBM的診斷中仍然需要與其他實驗室方法聯(lián)合使用，以提高敏感度、降低假陰性率。

有報道認為，血清學檢測方法不能作為診斷結(jié)核病的金標準[25]，但是其對菌陰肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的診斷具有較高的敏感度，2017年新版肺結(jié)核診斷標準(《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》)[18]中將γ-干擾素釋放試驗等納入其中。因此，筆者研究T-SPOT.TB在TBM診斷中的效能，得出其在TBM中的敏感度為29.6%，稍高于MGIT 960法的敏感度。吳長靜[26]報道T-SPOT.TB在檢測腦脊液中的敏感度達97.1%，段素霞[27]報道T-SPOT.TB檢測腦脊液的敏感度為91.1%，筆者得出的敏感度低于以上研究。分析原因主要有兩點：一是本研究41例患者標本的單個核細胞數(shù)量小于2.5×106個/ml，不符合試驗要求，結(jié)果判定為陰性，導致敏感度降低；二是由于長時間抗結(jié)核藥物治療過程中，MTB效應T細胞存活周期變短，進而導致T-SPOT.TB檢測結(jié)果呈假陰性。另外，T-SPOT.TB能否區(qū)別結(jié)核潛伏感染和活動性肺結(jié)核仍然有待商榷?？傮w而言，在TBM患者腦脊液滿足實驗要求的情況下，T-SPOT.TB試驗的敏感度和特異度較高，其在TBM的早期診斷中發(fā)揮著較大作用。

在TBM的診斷中，各種實驗室檢測技術(shù)均存在一定不足，MZN法敏感度低，MGIT 960法實驗周期長，PCR-熒光探針法和GeneXpert法存在一定的假陰性，T-SPOT.TB對實驗標本質(zhì)量要求較高，且可能無法區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活動性肺結(jié)核。因此，筆者嘗試研究細菌學方法組、分子生物學方法組、免疫學方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度，得出4種方法組的敏感度分別為31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。由此可見，不同檢測技術(shù)間綜合后的敏感度較單一檢測技術(shù)有所提高，細菌學方法組一定程度上彌補了MZN法敏感度低、MGIT 960法實驗周期長的不足，分子生物學方法組一定程度上降低了單一檢測技術(shù)的假陰性率，聯(lián)合診斷組大大提升了實驗室檢測技術(shù)在TBM早期診斷中的敏感度，不同程度克服了各單一檢測技術(shù)的缺點，但是其對患者經(jīng)濟條件要求較高。

綜上所述，本研究所采用的5種實驗室檢測技術(shù)在TBM的診斷中各有其優(yōu)缺點，其中分子生物學方法的敏感度優(yōu)于MGIT 960法和MZN法，且檢測周期短，建議作為TBM早期快速診斷的優(yōu)選方案。在實際臨床工作中，建議根據(jù)患者經(jīng)濟條件、抗結(jié)核治療時機、抗結(jié)核藥物的選擇及實驗室條件等綜合因素，選擇合適的聯(lián)合檢測方法，以提高TBM診斷的敏感度，降低各類檢測技術(shù)診斷的假陰性率，進而最大限度地幫助TBM患者得到早期快速診斷，減少誤診和漏診，促進對TBM患者進行早期規(guī)范的治療，降低致殘率和死亡率，改善TBM患者的預后。