孤獨(dú)癥譜系障礙動(dòng)物模型研究進(jìn)展

周榮易，黨偉利，周正，李華偉，張晰

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，河南省中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院兒童腦病診療康復(fù)中心， 鄭州 450000)

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)，國內(nèi)簡(jiǎn)稱孤獨(dú)癥、自閉癥等，是近年臨床上較常見的嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，臨床以語言發(fā)育障礙、社會(huì)交往及適應(yīng)能力異常、刻板重復(fù)行為和興趣狹窄等為主要特征[1]。近年來，本病全球發(fā)病率不斷增高，美國兒童發(fā)病率約為1/68，男孩發(fā)病率約為女孩的4.5倍[2]。ASD不僅會(huì)給兒童的一生帶來嚴(yán)重影響，更會(huì)給家庭帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響家庭和諧[3]。遺憾的是，目前本病病因及發(fā)病機(jī)制不明，亦沒有特效治療藥物[4]，更有報(bào)道顯示越來越多的ASD患兒常共患癲癇、注意缺陷多動(dòng)障礙、焦慮、抑郁等疾病，使得本病的治療復(fù)雜化[5-7]。目前在國際范圍內(nèi)，ASD已不僅僅是一個(gè)醫(yī)學(xué)問題，更是逐漸成為醫(yī)學(xué)背景下的急需解決的社會(huì)問題。因此，提高對(duì)本病的認(rèn)知和研究水平變得尤為重要。動(dòng)物模型因其可控性、易得性及預(yù)知性等特點(diǎn)，提供了優(yōu)于人體研究的優(yōu)勢(shì)，在人們對(duì)疾病病因及發(fā)病機(jī)制的探索中扮演著重要角色，ASD動(dòng)物模型成為人們探索神經(jīng)系統(tǒng)與孤獨(dú)癥發(fā)病關(guān)系的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)醫(yī)學(xué)界對(duì)ASD及其動(dòng)物模型的認(rèn)知程度非常有限，為增進(jìn)了解，本文特對(duì)近幾年國際上孤獨(dú)癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，以資參考。

1 基因模型

早在30年前，ASD發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)就得到了學(xué)術(shù)界的認(rèn)可?；陔p胞胎家庭和人群的研究表明，ASD是所有精神疾病中最易遺傳的疾病之一，遺傳率接近50%[8-9]，同卵雙胞胎患病一致率更是在70%～90%之間[10]。雖然人們已對(duì)遺傳因素與ASD發(fā)病的緊密關(guān)聯(lián)性形成了共識(shí)，但通過現(xiàn)有的技術(shù)方法，只有約20%的ASD病例找到了確定的遺傳證據(jù)，這些因素通常涉及染色體重排、基因拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNV)或點(diǎn)突變[11-12]?；诨蚣夹g(shù)的遺傳動(dòng)物模型應(yīng)運(yùn)而生。

1.1 Neuroligins(NLGNs)基因模型

突觸前NLGNs與突觸后神經(jīng)素共同構(gòu)成突觸復(fù)合體，介導(dǎo)突觸的穩(wěn)定性，并影響著谷氨酸能及γ-氨基丁酸能神經(jīng)突觸的分化。在已知的人體內(nèi)表達(dá)的五種NLGN基因中(NLGN1、NLGN2、NLGN3、NLGN 4X及NLGN 4Y)，NLGN3和NLGN4與ASD癥狀關(guān)系最為密切。核磁掃描顯示大鼠NLGN3基因敲除/敲入會(huì)導(dǎo)致大鼠腦容積顯著降低[13]，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)ASD癥狀，進(jìn)一步研究顯示，NLGN3基因敲入主要影響GABA抑制性突觸的功能而導(dǎo)致腦內(nèi)遞質(zhì)水平的失衡及腦發(fā)育紊亂[14]。NLGN4基因敲除后的表現(xiàn)與NLGN3類似，通過MRI檢測(cè)，NLGN4 KO大鼠的整個(gè)大腦以及小腦和腦干的體積減少[15]。同時(shí)，分子生物學(xué)研究顯示，這些大鼠腦皮層中興奮性PSD-95-免疫標(biāo)記點(diǎn)顯著減少，海馬CA3區(qū)中的GABAa受體和卟啉免疫反應(yīng)性突觸密度降低[16]。動(dòng)物模型顯示，NLGNs基因敲除引起腦突觸發(fā)育的改變及腦內(nèi)遞質(zhì)水平的異常，導(dǎo)致ASD癥狀的出現(xiàn)[17]。

1.2 Neurexins(NRXNs)基因模型

NRXNs基因編碼α-和β-尿嘧啶，并且作為NLGN的突觸前結(jié)合體配體，在突觸的融合、分化和成熟中扮演著重要的角色。臨床研究顯示具有NRXN1基因點(diǎn)突變的受試者廣泛存在智力殘疾、發(fā)育遲緩、言語障礙、ASD、癲癇、肌張力減退等一種或多種問題，并且罹患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)大大增高[18]，NRXN1基因點(diǎn)突變已經(jīng)證實(shí)和ASD發(fā)病有關(guān)。NRXN1含有兩個(gè)啟動(dòng)子，它們產(chǎn)生兩大類同種型Nrxn1α和Nrxn1β[19]。研究顯示，靶向敲除Nrxn1α基因，小鼠會(huì)展現(xiàn)出典型ASD核心癥狀，且與野生型(WT)小鼠對(duì)照相比，Nrxn1α基因敲除小鼠在腦結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出腦干和皮質(zhì)中抑制性突觸顯著減少現(xiàn)象[20]。此外，CNTNAP2作為NRXN基因家族的成員，主要編碼contactin-associated protein-like 2(CASPR2)基因。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在患有智力障礙及ASD的個(gè)體中觀察到CNTNAP2基因的隱性突變。CASPR2基因在促進(jìn)樹突軸突的發(fā)育[21]、維持突觸的穩(wěn)定性[22]和遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中必不可缺[23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組相比，CNTNAP2基因敲除小鼠顯示胼胝體和皮層軀體感覺調(diào)控神經(jīng)元的異常改變，海馬和紋狀體中的小白蛋白免疫反應(yīng)中間神經(jīng)元減少，軀體感覺皮層中的GABA能中間神經(jīng)元減少[24]，下丘腦室旁核中分泌催產(chǎn)素的神經(jīng)元減少等[25]，導(dǎo)致腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及遞質(zhì)傳遞的紊亂，出現(xiàn)ASD癥狀。除了NRXN1基因點(diǎn)突變外，NRXN3突變雖較為少見，但臨床上該位點(diǎn)基因的異常也與ASD的發(fā)生相關(guān)。

1.3 其他基因模型

除如上基因外，國內(nèi)外報(bào)道的基因模型尚有SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 3 (SHANK3)基因模型[26]、methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2)基因模型[27]、fragile X mental retardation 1 gene (FMR1)基因模型[28]、tuberous sclerosis complex 1/2 (TSC1/2)基因模型[29]等，這些基因均是在ASD臨床個(gè)體中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)基因敲除動(dòng)物模型驗(yàn)證，是對(duì)ASD的基因遺傳性的有力佐證，也是研究基因靶點(diǎn)調(diào)控的重點(diǎn)基因。近期還有報(bào)道新興的單基因模型出現(xiàn)，如chromodomain helicase DNA-binding protein 8 (CHD8)模型[30]、sodium channel, voltage-gated type IIα subunit (SCN2A)模型、synaptic GTPase activating protein 1 (SynGAP1)模型、glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B (GRIN2B)模型等[31]，尚有15q11-q13缺失和15q13.3微缺失[32]、15q11-13重復(fù)[33]、22q11.2缺失綜合征[34]、16p11.2剪除和復(fù)制綜合癥[35]等多基因異常模型?；虍惓ＤＰ途鶠樘囟ɑ蛉笔Ъ把芯磕康亩炷?，在適用性上有其針對(duì)性范圍，故在此不做全面詳細(xì)介紹。

2 特發(fā)性ASD動(dòng)物模型

遺傳因素雖在ASD的發(fā)病過程中占據(jù)重要地位，但ASD病因相當(dāng)復(fù)雜，多種因素均可能導(dǎo)致ASD的出現(xiàn)，表達(dá)單一突變的遺傳模型并不能完美地模擬ASD的所有病理特征。 因此，目前國際上已經(jīng)通過行為學(xué)等手法選擇了幾種小鼠和大鼠品系[36]，它們能夠較好的模擬ASD的核心癥狀。被認(rèn)為是特發(fā)性自閉癥的模型，因它們的ASD相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)并非由已知的基因突變引起，因此具有病因的未知性和研究的預(yù)測(cè)性。

2.1 近交系BTBR-T+ tf/J 小鼠模型

BTBR-T+tf/J近交系小鼠是目前公認(rèn)的最具ASD核心臨床特征且能夠穩(wěn)定子代復(fù)制的動(dòng)物模型[31]。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，BTBR-T+tf/J小鼠主要表現(xiàn)出交互性社交行為減少、發(fā)聲能力降低和高度刻板重復(fù)的自我理毛行為，這與人類的ASD核心癥狀極為類似[37-38]。有關(guān)BTBR-T+tf/J小鼠行為學(xué)特征異常的原因，有研究顯示BTBR-T+tf/J小鼠因編碼尿氨酸3-單加氧酶的基因Kmo的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性，從而引起氨基酸序列改變[39]。尿氨酸3-單加氧酶可以調(diào)節(jié)色氨酸代謝產(chǎn)物之一的犬尿酸的合成，而犬尿酸在其他精神疾病如精神分裂癥中表達(dá)異常。在臨床研究中，多數(shù)學(xué)者報(bào)道ASD患者多伴有胼胝體發(fā)育不全或胼胝體體積縮小，導(dǎo)致出現(xiàn)言語障礙及社會(huì)交流-交往障礙癥狀[40]。影像學(xué)研究顯示，BTBR-T+tf/J小鼠最顯著的神經(jīng)解剖學(xué)特征是胼胝體的的缺失及海馬神經(jīng)元的極度減少，腦白質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突觸投射異常和腦體積的減小[41]。同時(shí)，BTBR-T+tf/J小鼠存在腹側(cè)被蓋區(qū)、扣帶回、外側(cè)丘腦、后丘腦、枕葉和頂葉皮質(zhì)以及皮質(zhì)下區(qū)域的灰質(zhì)體積減少，而嗅球區(qū)、內(nèi)側(cè)前額葉和島葉皮質(zhì)、杏仁核和背側(cè)海馬體積增大[42]。這些發(fā)現(xiàn)與臨床ASD患者中腦灰質(zhì)體積隨時(shí)間而不斷減少具有一定的一致性，其余腦結(jié)構(gòu)區(qū)域的異?？赡軐?duì)臨床研究具有一定的提示預(yù)測(cè)性，需要不斷去研究。

2.2 近交系BALB/cByJ小鼠模型

BALB/cByJ是另一種近交小鼠品系，與具有高社交性的近交小鼠品系例如C57BL/6J和FVB/NJ小鼠相比，顯著表現(xiàn)出社交障礙和刻板行為。影像學(xué)上，BALB/cByJ小鼠亦表現(xiàn)出胼胝體體積的縮小。BALB/cByJ小鼠需特定的對(duì)照組，且不能完整呈現(xiàn)ASD的全部典型臨床癥狀，目前研究和應(yīng)用相對(duì)較少[43-44]。

3 調(diào)控環(huán)境因素ASD模型

3.1 丙戊酸(valproic acid, VPA)暴露

VPA是臨床上常用的抗癲癇藥及情緒穩(wěn)定劑，主要通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸的濃度減低神經(jīng)元的興奮性而發(fā)揮藥效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，孕期服用VPA的母親子代罹患ASD的風(fēng)險(xiǎn)要較正常人高出三倍[45-46]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者已通過母鼠孕期VPA暴露模擬出新生鼠的典型ASD模型，該模型也是國內(nèi)報(bào)道較多的動(dòng)物模型。Schneider T等[47]通過母鼠孕期腹腔注射VPA以觀察子代行為學(xué)的改變，發(fā)現(xiàn)子代大鼠表現(xiàn)出對(duì)疼痛敏感性減低、轉(zhuǎn)圈、理毛等刻板樣行為增多、探索性活動(dòng)減少、群體交往性行為減少等典型行為異常，這與ASD兒童的臨床表現(xiàn)極為類似。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前VPA暴露模型的神經(jīng)病理學(xué)改變程度取決于VPA的應(yīng)用劑量及持續(xù)時(shí)間[48]。在嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，母鼠孕期暴露于高于治療劑量的VPA會(huì)導(dǎo)致子代腦重量的減少[49-50]，而較低劑量不影響腦重[51]。而高劑量的急性暴露會(huì)導(dǎo)致大腦皮質(zhì)厚度的減少，而低劑量的慢性暴露會(huì)增加皮質(zhì)厚度[52]。長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，VPA暴露會(huì)導(dǎo)致子鼠早期前額葉皮質(zhì)和基底外側(cè)杏仁核的厚度減少，以及隨年齡增長(zhǎng)而持續(xù)存在的海馬CA1區(qū)厚度變薄[53]。受影響的其他大腦區(qū)域包括小腦體積的逐步縮小以及杏仁核體積的增大[54]。在神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)中，孕鼠VPA暴露的子代鼠表現(xiàn)出前額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)、小腦及外周血液中五羥色胺水平的改變，且這一改變與人類當(dāng)前的臨床研究結(jié)果高度類似[55]。孕期VPA暴露子代鼠展現(xiàn)出與ASD兒童類似的典型行為學(xué)表現(xiàn)，符合目前研究結(jié)果及理論假設(shè)的腦結(jié)構(gòu)及功能的損傷以及腦內(nèi)遞質(zhì)的改變。

除此之外，尚有報(bào)道丙酸(propionic acid, PPA)誘導(dǎo)模型[56]、特布他林誘導(dǎo)模型[57]、沙利度胺(Thalidomide)誘導(dǎo)模型[58]、博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)誘導(dǎo)模型等動(dòng)物模型[59]，造模方法及行為特征與VPA模型類似，而應(yīng)用廣度及認(rèn)可度上不及VPA模型，在此不做詳細(xì)論述。

3.2 母體自身抗體模型

在探尋ASD的致病因素過程中，發(fā)現(xiàn)極少部分患兒母親血清中存在一種抗胎兒腦蛋白的特異抗體(IgE13-IgE18、IgG)[60]。孕期階段，孕母的IgG等可經(jīng)胎盤為胎兒提供被動(dòng)免疫，保護(hù)胎兒的正常發(fā)育，然而母親產(chǎn)生的自身抗體也會(huì)經(jīng)由這一途徑影響胎兒。孕期的血腦屏障正在發(fā)育，極不完善，母親產(chǎn)生的抗胎兒腦蛋白的特異性抗體會(huì)輕易地影響腦部的發(fā)育，自身抗體的存在可能是ASD等疾病發(fā)病的重要原因，推測(cè)部分ASD患兒的發(fā)病可能與母體自身抗體有關(guān)[61]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，孕母擁有抗胎兒腦蛋白抗體與子代自閉癥有密切關(guān)聯(lián)[62]。在子宮內(nèi)暴露于母體自身抗體的實(shí)驗(yàn)小鼠在胎兒腦發(fā)育期間表現(xiàn)出皮質(zhì)神經(jīng)元過速增值[63]以及在出生后腦發(fā)育期內(nèi)大腦神經(jīng)元和腦體積的異?？焖偕L(zhǎng)[64]。在恒河猴孕母自身抗體模型中，子代腦容量亦顯示出異常的增加[65]，這與臨床上攜帶自身抗體母親所描述的患兒癥狀十分類似[66]。

3.3 母體免疫激活(maternal immune activation, MIA)模型

該模型的研究源于對(duì)ASD發(fā)病因素的流行病學(xué)調(diào)查，大樣本的流行病學(xué)資料顯示，孕期尤其是孕前3月內(nèi)的感染與ASD的發(fā)病密切相關(guān)[67]。學(xué)者據(jù)此開始研究小鼠暴露于妊娠期母體因感染等因素導(dǎo)致母體免疫激活(MIA)模型子代的行為學(xué)及神經(jīng)病理學(xué)特征[68]。為了誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，將孕期母鼠暴露于多核糖核苷酸-多聚胞苷酸(I：C)(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, Poly IC)、脂多糖、模擬病毒、細(xì)菌感染等環(huán)境，激活母體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)MIA模型[69]。研究發(fā)現(xiàn)，MIA模型的子代具有與臨床上ASD患兒相類似的行為表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為社交能力障礙及重復(fù)刻板行為增多[70-71]。例如，在妊娠期暴露于 Poly IC環(huán)境的C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出社交能力的降低以及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中高度重復(fù)刻板的挖掘行為[72]。產(chǎn)前暴露于流感病毒也導(dǎo)致后代C57BL/6J和BALB/c小鼠類似的行為改變[73]。藥物研究顯示，MIA后代通過注射抗嘌呤藥物蘇拉明(suramin)可顯著糾正社交行為及刻板行為[74-75]。MIA模型子代在出生后給予抗炎藥物ibudilast能夠較好緩解子代的重復(fù)刻板行為[76]。且在臨床上，應(yīng)用具有抗炎作用的噻唑烷二酮和匹格列酮能夠顯著改善孤獨(dú)癥兒童的易怒、刻板行為等，且對(duì)年齡較小的患者效果更為顯著[77]。MIA模型順應(yīng)流行病學(xué)結(jié)果而產(chǎn)生，且在藥理研究中得到不斷驗(yàn)證，對(duì)ASD發(fā)病機(jī)制的研究及未來的治療思路無疑是一個(gè)新的啟示。

4 對(duì)ASD動(dòng)物模型的展望

雖然越來越多的研究顯示諸多危險(xiǎn)因素與ASD的發(fā)病密切相關(guān)，但這些危險(xiǎn)因素均屬早期預(yù)防范疇，對(duì)臨床治療均無直接指導(dǎo)意義[78]。國內(nèi)對(duì)ASD的認(rèn)識(shí)及研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)遲于國外，詳細(xì)的動(dòng)物模型研究較少[59,69]。動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，高度還原ASD臨床特征及發(fā)病狀態(tài)的動(dòng)物模型是研究ASD的理想對(duì)象。目前圍繞ASD病因及發(fā)病機(jī)制而創(chuàng)制的動(dòng)物模型不斷增多，這一方面顯示出學(xué)術(shù)界對(duì)本病的不斷重視，同時(shí)模型的多樣化也造成了研究上的莫衷一是?？v觀國際及國內(nèi)對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，三種有效性廣泛用于評(píng)估模型與人類疾病的接近程度[79-81]。模型呈現(xiàn)的有效性越多，其對(duì)人類疾病的呈現(xiàn)效果就越好。這些有效性不僅在評(píng)估動(dòng)物模型的可靠性上至關(guān)重要，其在評(píng)估藥物治療的療效時(shí)也不可替代。第一種是結(jié)構(gòu)有效性，即模型要符合一定的理論假說且病理生理改變應(yīng)與假說或理論相一致。例如基因突變或環(huán)境暴露于某些因素所制造的模型。從這一點(diǎn)來看，較好符合結(jié)構(gòu)有效性的模型首推單基因變異的ASD動(dòng)物模型，環(huán)境因素模型也能夠較好的符合這一特征。第二種是表面有效性，即模型能夠在行為學(xué)等多方面模擬疾病的典型特征。在ASD動(dòng)物模型中，能夠模擬刻板行為及社交、言語障礙等典型臨床癥狀即具有較好的表面有效性。從這一點(diǎn)而論，幾乎當(dāng)前所有報(bào)道的ASD動(dòng)物模型均不同程度的符合這一特性，而BTBR模型、VPA模型報(bào)道的表面有效性最為接近臨床實(shí)際。第三種是預(yù)測(cè)有效性，即模型的藥理學(xué)反映及非藥理學(xué)反應(yīng)與臨床治療表現(xiàn)相一致，并能夠?yàn)檫h(yuǎn)期的治療及發(fā)病機(jī)制研究提供預(yù)測(cè)性。關(guān)于預(yù)測(cè)有效性，由于當(dāng)前沒有直接藥物可用于治療人類ASD所表現(xiàn)出的社會(huì)交往障礙及復(fù)雜多樣的重復(fù)刻板行為，因此無法將藥物對(duì)人類和動(dòng)物行為的影響進(jìn)行比較分析，進(jìn)而預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期的效果及探索其發(fā)病機(jī)制。所以，從這一角度來看，目前除了特定單基因的靶向研究外，沒有任何一種模型符合這一行特性。綜合以上特性，從目前來看，孕期VPA暴露子代鼠展現(xiàn)出與ASD兒童類似的典型行為學(xué)表現(xiàn)、符合目前研究結(jié)果及理論假設(shè)的腦結(jié)構(gòu)及功能的損傷以及腦內(nèi)遞質(zhì)的改變，結(jié)構(gòu)有效性及表面有效性較好，對(duì)于研究孕期、胎產(chǎn)因素相關(guān)的ASD病因及發(fā)病機(jī)制研究較為符合。BTBR模型能夠突出的模擬刻板行為及社交障礙的特征，具有較VPA模型更優(yōu)的表面有效性，其腦功能及結(jié)構(gòu)的異常亦符合當(dāng)前的理論假設(shè)，具有較好的結(jié)構(gòu)效度，能夠用于一般性的ASD病因及發(fā)病機(jī)制研究，適應(yīng)性更為廣泛。而基因遺傳模型因其明確的造模目的，雖在當(dāng)前能夠較好的模型三種有效性，但因其特定的應(yīng)用范圍及高昂的價(jià)格，限制了應(yīng)用廣度及普適性。因此，在ASD的研究中，建議依據(jù)研究計(jì)劃優(yōu)先選擇BTBR模型及VPA模型，更好的服務(wù)于研究工作，推進(jìn)ASD的不斷深入研究。

總結(jié)而論，孤獨(dú)癥是一種復(fù)雜的發(fā)育障礙性疾病，基因異常、腦功能異常等都是近來人們不斷探索的方向。ASD的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，目前，人們雖通過流行病學(xué)資料、臨床觀察等多種途徑掌握了一些易感因素，但對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。充分發(fā)掘利用動(dòng)物模型是研究孤獨(dú)癥發(fā)病原因及治療方法的最佳選擇。當(dāng)前的模型尚沒有符合三個(gè)基本有效性的理想的病理學(xué)及病因?qū)W模型。