基因編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用研究進(jìn)展

肖義軍 黃艷萍 (福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

品種培育在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位十分重要，人類自從種植作物以來，就在不斷地選育具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物性狀，這實(shí)際上是在利用作物的自然基因突變。隨著改造自然能力的提高，人類又開始利用輻射和化學(xué)誘變等手段人為加快突變頻率，以便更快更好地獲得作物新品種。但無論是天然突變還是誘發(fā)突變，突變的產(chǎn)生都是隨機(jī)的，需要經(jīng)過艱苦漫長的選育過程才能得到穩(wěn)定的新品種，一個(gè)新品種的育成往往需要十幾甚至幾十年的不懈努力。分子生物學(xué)的發(fā)展使得人們可以采用基因工程手段加快作物育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物育種中取得了極大成功。然而由于生命活動(dòng)的復(fù)雜性，目前對(duì)其中的規(guī)律并不完全清楚，所以公眾對(duì)外源基因的導(dǎo)入是否會(huì)引起作物自身產(chǎn)生一些無法預(yù)料的變化，從而影響轉(zhuǎn)基因作物的安全性，存在廣泛的質(zhì)疑。由于特異性核酸酶的發(fā)現(xiàn)，目前出現(xiàn)的新一代基因工程技術(shù)——基因編輯技術(shù)可通過對(duì)作物自身基因進(jìn)行精確改變，而不需要外源基因的導(dǎo)入就能培育新品種，因而受到了作物育種家的極大關(guān)注，將對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的影響。本文介紹基因編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用前景及目前面臨的挑戰(zhàn)。

1 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)是指對(duì)基因組中的某些DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)改造的遺傳操作技術(shù)，其基本原理是通過人工構(gòu)建能特異性切割DNA序列的核酸酶，對(duì)目的基因片段進(jìn)行精準(zhǔn)的靶向剪切，使DNA雙鏈斷裂，隨后激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生基因修改。常用的核酸酶主要有鋅指核酸內(nèi)切酶(zincfinger nucleases， ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator like effector nucleases， TALENs)以及成簇規(guī)律的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nuclease， CRISPR/Cas9)，其中CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)以其簡單、精確、高效和低成本而得到廣泛應(yīng)用。

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制 CRISPR/Cas系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌及古細(xì)菌中。作為細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)，通過靶向結(jié)合降解外源DNA，能對(duì)外來病毒和噬菌體的侵染產(chǎn)生抵制作用。這些存在于微生物基因組且包含間隔重復(fù)序列的位點(diǎn)被命名為成簇規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR)。CRISPR/Cas系統(tǒng)通常分為兩大類： 第Ⅰ類是有多個(gè)Cas蛋白組成的復(fù)合體來行使核酸酶功能，第Ⅱ類是由單個(gè)Cas蛋白(如Cas9等)行使核酸酶功能。CRISPR/Cas9屬于第Ⅱ類，只需要成熟的cr RNA(CRISPR-derived RNA)、tracr RNA(trans-activating chimeric RNA，反式激活嵌合RNA)和單個(gè)Cas9蛋白(核酸酶)就能實(shí)現(xiàn)對(duì)外源DNA的切割[1]。人工改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由引導(dǎo)RNA(single guide RNA， sgRNA)和Cas9蛋白結(jié)構(gòu)域組成。其中，sgRNA起精確定位作用，其5′端前20個(gè)核苷酸序列決定Cas9蛋白特異性切割基因組DNA的部位；工作時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA和Cas9形成嵌合蛋白，切割與sgRNA 5′端前20個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的DNA雙鏈，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，然后通過同源重組或非同源末端連接修復(fù)途徑產(chǎn)生基因突變。

1.2 DNA斷裂修復(fù)機(jī)制 基因編輯有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)： 一個(gè)是對(duì)基因的精確剪切，另一個(gè)是細(xì)胞DNA的自身修復(fù)。正常情況下細(xì)胞中一旦出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)DNA自我修復(fù)途徑，同源重組與非同源末端連接是細(xì)胞修復(fù)DNA雙鏈斷裂的兩種常見方式。

非同源末端連接是斷裂處兩端的DNA在一些修復(fù)元件的參與下直接修復(fù)的通路，是主要的修復(fù)機(jī)制，通常引起部分堿基的丟失，少數(shù)情況下也會(huì)有堿基插入，導(dǎo)致的結(jié)果是基因敲除。非同源末端連接技術(shù)相對(duì)簡單，沒有外來DNA的插入，造成的基因功能丟失類似于天然突變的結(jié)果，但它遠(yuǎn)比天然突變的效率高，也遠(yuǎn)比化學(xué)物理誘變精確，是目前基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物育種中的主要作用方式。

同源重組是以損傷區(qū)域DNA的同源序列作為模板進(jìn)行的精確修復(fù)，可保證基因組的準(zhǔn)確性。同源重組可以實(shí)現(xiàn)精確的基因替代，其意義遠(yuǎn)比非同源末端連接重大。但由于其是通過基因替代的方式來實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯，通常需要引入與斷裂處原序列相同的DNA修復(fù)模板，使之以同源重組的方式原位插入到染色體中，這就涉及到了外源DNA轉(zhuǎn)入的問題。但與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因不同的是： 首先，這個(gè)基因是該作物的可雜交品種中已經(jīng)存在的同源基因，這樣的作物品種采用傳統(tǒng)雜交技術(shù)也能做到，只是后者更費(fèi)時(shí)費(fèi)力而已；其次，在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因是隨機(jī)整合到基因組中，而同源重組則是精確地將基因插入到基因組中的預(yù)定位置。如果人們能接受雜交育種的話，則沒有理由不接受這樣的作物，因?yàn)閭鹘y(tǒng)雜交實(shí)際存在將目的性狀基因附近的DNA片段帶入的可能性，結(jié)果更不可控。

2 基因編輯技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用

由于目前公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的諸多質(zhì)疑和法律對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的嚴(yán)格約束，作物育種家越來越多地將注意力轉(zhuǎn)移到了基因編輯技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)具有以下優(yōu)越性： ①可研究、鑒定和篩選與重要性狀相關(guān)的基因；②能更準(zhǔn)確快速地設(shè)計(jì)、改造作物品種；③可有針對(duì)性地聚合多個(gè)優(yōu)良性狀，以提高植物的抗性、產(chǎn)量或改良品質(zhì)。目前基因編輯技術(shù)已應(yīng)用于水稻、小麥、西紅柿、馬鈴薯和煙草等多種作物的育種中。

2.1 作物抗性性狀的改良 通過基因編輯技術(shù)定點(diǎn)敲除抗性負(fù)調(diào)控因子基因或增強(qiáng)正調(diào)控因子的基因表達(dá)，以及通過編碼區(qū)定點(diǎn)替換改變相關(guān)基因功能，都能在不同程度上提高作物對(duì)環(huán)境的抗性，是作物抗性育種的重要途徑。

白粉病是由麥類白粉菌引起的病害，主要危害大麥、小麥等禾本科植物，降低其產(chǎn)量。大麥的白粉病病原菌感病基因(MLO)功能的喪失可獲得對(duì)白粉病的廣譜抗性。非洲野生大麥中存在自然突變的抗性品種，通過與歐洲原有種植大麥雜交，培育出了具有持久抗性的大麥品種。但在自然界中無法找到天然突變的小麥抗白粉病抗性植株，因?yàn)樾←準(zhǔn)橇扼w，自然情況下6個(gè)MLO等位基因基本不可能同時(shí)發(fā)生突變，而二倍體大麥與六倍體小麥存在生殖隔離，大麥突變品種不能與小麥進(jìn)行雜交。研究人員運(yùn)用TALENs技術(shù)定點(diǎn)突變小麥的6個(gè)等位基因，創(chuàng)制出一種對(duì)白粉病有持久廣譜抗性的新型小麥品種。

稻瘟病是水稻的重要病害，常造成水稻產(chǎn)量的大面積減產(chǎn)，目前主要的防治手段是施用農(nóng)藥與培育抗病品種。但過量使用農(nóng)藥易造成環(huán)境污染、產(chǎn)生耐藥性等問題。Wang等[2]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻中負(fù)責(zé)調(diào)控稻瘟病菌的抗性基因(OsERF922)進(jìn)行精準(zhǔn)敲除后，培育出抗稻瘟病的純合突變株系。

柑橘潰瘍病是柑橘生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，而導(dǎo)致潰瘍病的則是柑橘的關(guān)鍵感病基因(CsLOB1)。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)CsLOB1的編碼區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得的突變體植株對(duì)潰瘍病的抗性顯著增強(qiáng)。

隨著除草劑在作物生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，培育抗除草劑的作物新品種是作物育種的一個(gè)重要目標(biāo)。高彩霞團(tuán)隊(duì)采用優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了對(duì)草甘膦具有抗性的水稻品種。乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase， ALS)是支鏈蛋白質(zhì)合成通路中的第一個(gè)重要酶，ALS中特定氨基酸突變可以提高植物對(duì)乙酰乳酸合酶類除草劑的抗性。已有不少研究通過基因編輯的手段對(duì)其部分堿基進(jìn)行突變，獲得了抗磺酰脲類除草劑的水稻突變體[3]。

2.2 作物產(chǎn)量的改良 在作物產(chǎn)量改良方面，目前在水稻上做的工作較多，主要是通過對(duì)相關(guān)產(chǎn)量的負(fù)調(diào)控因子基因進(jìn)行定向修飾達(dá)到增產(chǎn)的目的。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作發(fā)現(xiàn)，采用基因編輯技術(shù)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾后，可獲得每穗粒數(shù)增加、單粒更重、株型能直立且具有分蘗少、植株矮化等性狀的突變株系[3]。

小麥粒長和粒重負(fù)調(diào)控基因(TaGASR7)和直立型密穗基因(TaDEP1)是小麥的產(chǎn)量相關(guān)基因，ZHANG[4]等利用瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)量相關(guān)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯后，發(fā)現(xiàn)獲得的純合突變株分別出現(xiàn)粒重顯著增加、株系明顯變矮的性狀。

番茄的開花阻遏物基因(SP5G)負(fù)責(zé)合成抗成花素激素，若抗成花素激素含量增加，則開花時(shí)間延遲、產(chǎn)量降低。SOYK等[5]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)野生番茄的SP5G基因進(jìn)行定向突變后，番茄的開花和成熟時(shí)間能提前2周左右，且產(chǎn)量顯著增加。

2.3 品種品質(zhì)的改良 直鏈淀粉含量與水稻品質(zhì)密切相關(guān)。MA等[6]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變水稻直鏈淀粉合成酶基因(OsWaxy)，所獲突變體的直鏈淀粉含量從14.6%下降至2.6%，由此獲得了糯性品質(zhì)。SUN等[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻糖苷水解酶基因(BE1)和淀粉分支酶Ⅱb基因(BEIIb)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，雖然BE1突變株相比野生型在粒型、總淀粉含量、直鏈淀粉含量等指標(biāo)上未有顯著差異，但BEIIb突變株相比野生型粒型顯著變小、總淀粉含量和直鏈淀粉含量均顯著增加。

在水稻的8號(hào)染色體上存在的甜菜堿醛脫氫酶基因(OsBADH2)表達(dá)時(shí)，水稻不具有香氣。利用TALENs技術(shù)敲除水稻品種“日本睛”中的OsBADH2基因，使無香味的稻米產(chǎn)生了香味[3]。

雙孢菇(Agaricusbisporus)有6個(gè)多酚氧化酶基因，非常容易褐變。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除雙孢菇的1個(gè)多酚氧化酶基因，獲得的突變雙孢菇中多酚氧化酶的活性降低了30%，具有了抗褐變能力?？购肿兡⒐接?016年4月成為第一個(gè)豁免美國農(nóng)業(yè)部監(jiān)管的CRISPR編輯作物[8]。

2.4 創(chuàng)制水稻雄性不育系 光、溫敏核雄性不育系的發(fā)現(xiàn)使雜交水稻由三系法走向兩系法，傳統(tǒng)方法獲得一個(gè)光或溫敏核雄性不育系品種通常需要十年左右時(shí)間。上海交大和華南農(nóng)大利用基因編輯技術(shù)對(duì)水稻相關(guān)基因進(jìn)行編輯，分別獲得了光、溫敏核雄性不育系，大大加快了培育進(jìn)程[3]。

3 基因編輯技術(shù)在作物育種上面臨的問題

3.1 技術(shù)方面的問題 目前主流的基因編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9，但目前該技術(shù)尚存在兩個(gè)重要的技術(shù)問題： ①脫靶效應(yīng)(Off-target effects)，因?yàn)樵诨蚪M中存在許多相似序列的DNA片段，核酸酶在切割特定基因片段時(shí)，有可能會(huì)切割相似序列而產(chǎn)生錯(cuò)誤切割，這種在特定位點(diǎn)之外的錯(cuò)誤切割造成非預(yù)期基因突變的現(xiàn)象稱為脫靶效應(yīng)。②外源基因的問題，目前CRISPR/Cas9常規(guī)的方法是首先將sgRNA和Cas9蛋白基因構(gòu)建到合適的載體中，再經(jīng)由載體導(dǎo)入到細(xì)胞中來培育獲得基因修飾的植株，然后通過自交或雜交的辦法將外源基因剔除，盡管在最后的植株中沒有外源基因，但操作過程中實(shí)際是有外源基因?qū)氲?，而且，如果采用質(zhì)粒做載體，降解后的小片段質(zhì)粒DNA有可能會(huì)插入宿主DNA中而無法檢測出來。從目前技術(shù)發(fā)展的趨勢看，這兩個(gè)問題應(yīng)該不難得到解決。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)至今只有5年左右，但技術(shù)已進(jìn)行了多次優(yōu)化，如： 目前利用Cas9變體已經(jīng)可以將脫靶效應(yīng)降低到檢測不到的水平[9]，基于CRISPR/Cas9的植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)和植物基因組定點(diǎn)插入和替換系統(tǒng)，以及全程無外源DNA的DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)[3]等不斷出現(xiàn)和改進(jìn)。此外，目前基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物育種主要是通過定點(diǎn)敲除靶標(biāo)基因，造成基因的功能缺失來實(shí)現(xiàn)性狀改良，因此敲除的基因必須是目標(biāo)性狀的負(fù)調(diào)控因子。多數(shù)情況下，作物性狀改良需要獲得基因功能，所以基因定點(diǎn)替換或插入顯得更為重要。但植物細(xì)胞中同源重組效率很低，目前已報(bào)道的植物基因組片段定點(diǎn)替換效率在水稻、玉米和擬南芥中普遍低于1%[3]。大部分控制重要農(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因目前還無法高效、精準(zhǔn)地進(jìn)行編輯，這一情況極大地限制了基因編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用。

3.2 法律監(jiān)管方面的問題 基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為作物分子育種提供了極好的機(jī)遇，但對(duì)于基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物，目前國際上尚未有明確一致的定論，其監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)存在較大爭議。美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門認(rèn)為基因編輯作物(genome edited crop， GEC)是通過細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生的突變體，與作物自然突變以及物理化學(xué)方法誘導(dǎo)的突變極為相似，因此GEC不被定義為轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism， GMO)[10]。美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門目前已認(rèn)定通過ZFNs技術(shù)創(chuàng)制的低植酸玉米、通過TALEN技術(shù)創(chuàng)制的耐冷藏馬鈴薯品種和高油酸、低亞油酸大豆，以及通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米等5種基因編輯作物新品種不屬于GMO范疇。歐盟認(rèn)為只要有外源DNA轉(zhuǎn)入，不論最終植物中是否存在外源DNA，都被定義為GMO。事實(shí)上，從科學(xué)角度來講，基因編輯誘導(dǎo)的突變與自然突變以及物理和化學(xué)方法誘導(dǎo)的突變結(jié)果完全一樣，最終產(chǎn)品無法區(qū)分。中國目前對(duì)于基因編輯作物的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)尚無明確的規(guī)定。盡管基因編輯技術(shù)出現(xiàn)才十多年的時(shí)間，但已顯示出了對(duì)農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)的重大影響力，目前我國的基因編輯技術(shù)處于世界前列，合理的政策法規(guī)對(duì)正確引導(dǎo)我國基因編輯育種技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要，而基因編輯育種技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用對(duì)于我國的糧食安全性十分重要。