HMGB1對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞骨鈣蛋白和骨涎蛋白表達(dá)的影響

蔡軍，欒毅君，瞿海濤，劉慧超，王利艷，徐巖

(1 濟(jì)南市口腔醫(yī)院，濟(jì)南250014；2 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

牙周病是一類以牙齒支持組織持續(xù)破壞為主要特征的細(xì)菌感染性疾病，是導(dǎo)致人類牙齒缺失的重要原因。其中，牙槽骨的破壞與吸收是牙周病的主要病理改變之一[1]。研究表明，菌斑細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物引發(fā)的炎癥反應(yīng)、宿主抵抗外界炎癥能力降低以及宿主對(duì)牙周致病菌易感性增加等均可導(dǎo)致牙槽骨的破壞與吸收[2]。牙周膜成纖維細(xì)胞(PDLCs)作為牙周組織的主要功能細(xì)胞，在牙槽骨的損傷和修復(fù)中具有重要作用[1]。PDLCs有很強(qiáng)的再生和礦化能力，在一定條件下能夠向成骨或成牙骨質(zhì)方向分化，可參與牙槽骨的修復(fù)[3]。骨鈣蛋白(OC)是一種非膠原蛋白，可反映骨代謝瞬間變化[4]。特定位點(diǎn)齦溝液OC水平可反映局部牙槽骨破壞情況[5]。骨涎蛋白(BSP)是骨新陳代謝的標(biāo)志物，能激活成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞或類成骨細(xì)胞，引導(dǎo)骨礦化，促進(jìn)骨或牙骨質(zhì)形成[6]。因此，PDLCs中OC、BSP表達(dá)變化可能會(huì)影響PDLCs成骨方向分化以及牙周組織局部成骨微環(huán)境[7]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種重要的晚期炎癥因子，在許多感染性或無(wú)菌性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8～10]。有研究表明，牙周病患者牙齦組織以及齦溝液中HMGB1表達(dá)升高[11]。提示HMGB1可能參與牙周病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究觀察了HMGB1對(duì)人PDLCs中OC、BSP表達(dá)的影響，旨在探討HMGB1在牙周骨組織破壞中的作用機(jī)制?，F(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料

收集2016年10月～2017年10月濟(jì)南市口腔醫(yī)院行正畸治療拔除的前磨牙10顆。行正畸治療者體檢健康，無(wú)齲病或牙周病等，年齡12～18歲。本研究經(jīng)濟(jì)南市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司；抗波形絲蛋白抗體、抗細(xì)胞角蛋白抗體，武漢博士德生物工程有限公司；OC(sc-74495)、BSP(sc-73497)、β-actin(sc-81178)一抗，美國(guó)Santa Cruz公司；RNeasy Mini Kit試劑盒，德國(guó)Qiagen公司；SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；TaKaRa Ex Taq試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。酶聯(lián)免疫分析儀，芬蘭Thermo Labsystems公司；倒置相差顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

2 方法與結(jié)果

2.2 人PDLCs培養(yǎng)與鑒定 將正畸治療拔除的前磨牙用無(wú)菌PBS清洗3次，刮除牙根中1/3牙周膜，剪切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，平鋪于培養(yǎng)瓶底；然后將培養(yǎng)瓶加入含15% FBS和100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基10 mL，瓶底向上倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2、95%濕度下培養(yǎng)2～3 h；待組織塊貼壁牢固，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取傳4～6代PDLCs，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1 mL，接種于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的12孔板中，37 ℃、5% CO2、95%濕度下繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞融合50%時(shí)，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定。將固定好的細(xì)胞爬片用PBS充分振洗，在爬片表面滴加3%過(guò)氧化氫，37 ℃溫箱孵育20 min；羊血清37 ℃封閉30 min，分別滴加抗波形絲蛋白和抗細(xì)胞角蛋白一抗，37 ℃濕盒孵育2 h；然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色5～6 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，倒置顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，所培養(yǎng)細(xì)胞抗波形絲蛋白陽(yáng)性、抗細(xì)胞角蛋白陰性，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞是來(lái)源于中胚層的PDLCs。

2.3 HMGB1在體外對(duì)人PDLCs OC和BSP表達(dá)的影響

2.3.1 細(xì)胞分組處理 選擇傳4～6代PDLCs，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1.5 mL，隨機(jī)分為對(duì)照組和HMGB1組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。HMGB1組加入適量HMGB1，使其終濃度為100 ng/mL，對(duì)照組不予HMGB1處理。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.2 各組OC、BSP mRNA表達(dá)變化 采用RT-PCR法檢測(cè)OC、BSP mRNA表達(dá)。收集各組培養(yǎng)24 h細(xì)胞，按RNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格。調(diào)整總RNA濃度為300 ng/μL，根據(jù)SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按照TaKaRa Ex Taq PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：OC上游引物5′-GAGGGCAGCGAGGTAGTGAAG-3′，下游引物5′-GATGTGGTCAGCCAACTCGTCA-3′；BSP上游引物5′-GCACCTCGAAGACACAACCTC-3′，下游引物5′-TGACCATCATAGCCATCGTAGC-3′；GAPDH上游引物5′-GCTCTCCAGAACATCTACC-3′，下游引物5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.126 μL，dNTP 2 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，dH2O 15.374 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。各組OC、BSP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組OC、BSP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3.3 各組OC、BSP蛋白表達(dá)變化 采用Western blotting法檢測(cè)OC、BSP蛋白表達(dá)。收集各組培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入適量含PMSF的RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。取部分總蛋白，按照1∶1體積比加入2×loading buffer，混勻，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白35 μg行10% SDS-PAGE，先以80 V電壓跑膠至Marker膠充分分離，再調(diào)整電壓至120 V，繼續(xù)跑膠1 h，至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠底部時(shí)結(jié)束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入OC、BSP一抗(稀釋比均為1∶200)及β-actin一抗(稀釋比為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST沖洗10 min×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比為1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST沖洗10 min×3次，ECL發(fā)光，暗室中顯影、定影。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描各蛋白電泳條帶，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。各組OC、BSP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組OC、BSP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

牙周病是一類由菌斑微生物引發(fā)的牙周支持組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì))炎癥破壞性疾病，其中牙槽骨吸收是牙周病的特征性表現(xiàn)。但目前對(duì)牙槽骨吸收的具體機(jī)制尚不十分明確[12]。

在感染和損傷性疾病中，HMGB1是一個(gè)募集、激活免疫細(xì)胞的重要因子，并且在炎癥的遷延、惡化中發(fā)揮重要作用[10]。由于牙周病是一種炎癥性疾病，故推測(cè)HMGB1在牙周病進(jìn)展過(guò)程中可能亦具有重要作用。Ebe等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1分布于牙周袋上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，而牙周袋中致病菌的代謝產(chǎn)物可誘發(fā)牙周膜細(xì)胞壞死，繼而釋放HMGB1。HMGB1亦可高表達(dá)于牙周病患者牙齦上皮細(xì)胞中，且其齦溝液HMGB1水平明顯升高[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的HMGB1可使PDLCs中RANKL/OPG升高，并能誘導(dǎo)炎癥因子IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)[15]。這些研究結(jié)果提示，HMGB1可能參與牙槽骨的破壞和吸收。

OC是一種激素樣蛋白，可激活前破骨細(xì)胞，加速誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨吸收[4]。孫靖臨等[5]研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液OC水平明顯高于健康者，提示牙周病變處局部牙槽骨有破壞，故其水平明顯升高。宗敏等[16]研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性牙周炎患者齦溝液OC水平明顯高于健康者，經(jīng)治療，齦溝液OC水平明顯降低。表明特定位點(diǎn)齦溝液OC水平可反映局部牙槽骨變化。BSP是一種分泌蛋白，對(duì)鈣和羥基磷灰石有高親和力。BSP亦是一種骨代謝標(biāo)志物，能夠誘導(dǎo)激活成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞或類成骨細(xì)胞，引導(dǎo)骨礦化，促進(jìn)骨和牙骨質(zhì)形成[6，17]。在牙周組織中，BSP可促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的附著和分化，繼而促進(jìn)牙周纖維生長(zhǎng)。在非細(xì)胞牙骨質(zhì)的形成過(guò)程中，BSP有助于保持牙根面牙骨質(zhì)的完整性以及牙周組織功能的發(fā)揮[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1組OC mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，與以往文獻(xiàn)[5，16]報(bào)道基本一致。表明牙周炎患者齦溝液中增多的OC亦可能來(lái)源于牙周袋內(nèi)感染的PDLCs分泌，而HMGB1能通過(guò)增加OC表達(dá)，促進(jìn)牙周骨組織中破骨細(xì)胞分化，加重骨吸收，進(jìn)而使牙周炎癥遷延。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HMGB1組BSP mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，表明HMGB1可抑制牙周骨組織的修復(fù)和再礦化，加重牙周骨組織破壞，導(dǎo)致炎癥過(guò)程持續(xù)。但HMGB1對(duì)OC、BSP具體調(diào)控機(jī)制以及在牙周其他組織中的作用尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，HMGB1可能通過(guò)影響人PDLCs中OC、BSP表達(dá)，從而參與牙周病中牙槽骨的破壞，繼而促進(jìn)牙周病發(fā)展。