降脂紅曲發(fā)酵工藝的研究進展

程玉冰，胡海峰，*，閔濤玲

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海201203；2.國藥集團健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203）

近年來，高膽固醇血癥發(fā)生率正以驚人的速度增長，由于其可引發(fā)多種心血管疾病并發(fā)癥，因此嚴重威脅到公眾健康。使用降脂藥物治療高膽固醇血癥存在較多副作用，因此通過服用食品或功能性產(chǎn)品來達到降脂療效[1]，引起了廣大的關(guān)注。紅曲菌在次級代謝的過程中，可產(chǎn)生具有降脂活性的莫納可林K（Monacolin K，以下簡稱MK）。服用含有MK的紅曲制品既可降脂，又能避免藥物引發(fā)的副作用，在降脂市場上占有重要地位。

1 降脂紅曲的發(fā)展歷史

紅曲是指將紅曲菌接種于適宜發(fā)酵基質(zhì)后經(jīng)培養(yǎng)所得的發(fā)酵物，屬于我國傳統(tǒng)的藥食同源發(fā)酵產(chǎn)品，是我國寶貴的科學(xué)文化遺產(chǎn)。在我國古代，紅曲又稱為丹曲，《本草綱目》中曾記載：“紅曲以白飯蒸罨成紅色，與營血有同氣相求之理，能生血而健脾，氣溫達肝，味甘益脾之力也”。古代對紅曲的食療作用定義為：“消食、活血、健脾、燥胃”。近年來，隨著國內(nèi)外研究者對紅曲的深入研究，其顯著的降脂活性被發(fā)現(xiàn)。在20世紀(jì)70年代，日本的微生物學(xué)家Akira Endo和Merck&Co.制藥公司的研究人員從紫紅曲霉中分離出了monacolins類物質(zhì)，此后紅曲作為一種非處方膳食補充劑，成為洛伐他汀類藥物的替代品，活躍在降脂市場中[2]。在20世紀(jì)90年代，臨床試驗表明紅曲含有他汀類藥物洛伐他汀的天然形式，能夠像他汀類藥物一樣有效地降低膽固醇[3]。因此加強對紅曲的深入研究，加強對紅曲制品監(jiān)管力度，使紅曲制品標(biāo)準(zhǔn)化，確保紅曲食用安全性迫在眉睫。

2 紅曲菌發(fā)酵的主要成分

紅曲菌在次級代謝的過程中，可產(chǎn)生MK，MK（圖1）即洛伐他汀，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-羥基內(nèi)酯基團[4]，其內(nèi)酯環(huán)經(jīng)開環(huán)反應(yīng)后，β-羥基內(nèi)酯基團可轉(zhuǎn)化為β-羥基酸，成為MK的酸式結(jié)構(gòu)（圖2），MK的酸式結(jié)構(gòu)與膽固醇合成過程中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的結(jié)構(gòu)最為相似，因而能夠阻斷膽固醇合成通路，降低膽固醇合成。Monacolin K的內(nèi)酯形式與它的羥基酸產(chǎn)物在不同pH值條件下可以相互轉(zhuǎn)化，經(jīng)人體產(chǎn)生的羥基酶水解后，發(fā)揮降脂活性。目前，MK的生產(chǎn)主要依靠生物發(fā)酵法，生物發(fā)酵能夠避免化學(xué)法生產(chǎn)所具有的反應(yīng)條件苛刻、副反應(yīng)多、產(chǎn)品分離純化困難等一些缺點，具有一定優(yōu)勢[5]。工業(yè)生產(chǎn)中主要涉及的他汀產(chǎn)生菌包括土曲霉、紅曲霉、青霉菌及鏈霉菌[6]。與其他發(fā)酵菌株相比，紅曲發(fā)酵物中活性物質(zhì)更加豐富，且其固體發(fā)酵物可不經(jīng)提取分離，直接作為保健食品所食用，因而有更大優(yōu)勢。

另外，紅曲菌具有豐富的聚酮合成體系，能夠產(chǎn)生多種豐富的代謝產(chǎn)物：除具有顯著降脂活性的MK外，其還可產(chǎn)生具有降壓及抗抑郁活性的γ-氨基丁酸，研究表明[7]，在小鼠抗抑郁實驗的長期測試中，提供相同劑量的γ-氨基丁酸及紅曲發(fā)酵物，后者具有比γ-氨基丁酸更好的抗抑郁效果，有更大的研究潛力。近年來，隨著人們對色素需求量的日益增加，利用微生物來生產(chǎn)色素凸顯出巨大的優(yōu)勢：微生物易培養(yǎng)，色素產(chǎn)量高、易獲得、可避免化學(xué)合成色素所帶來的危害[8]，具有廣闊的發(fā)展前景。紅曲色素作為一種優(yōu)質(zhì)的天然可食用色素，具有多種優(yōu)勢：紅曲色素穩(wěn)定性好、具有抗炎[9]及抗菌[10]活性，可成為有致癌隱患—亞硝酸鹽的替代品，在著色的同時還可發(fā)揮抑菌作用。另外，在紅曲豐富的菌絲體中還含有具有抗氧化活性的輔酶Q10[11]；紅曲還可產(chǎn)生各種豐富酶類，如淀粉酶、酯化酶、糖化酶等。但是，紅曲菌發(fā)酵也會產(chǎn)生一種具有致癌活性的真菌毒素—桔霉素，因此，在提高目標(biāo)產(chǎn)物的同時，控制桔霉素的產(chǎn)生也尤為重要。對紅曲進行不同程度的菌種篩選及不同性質(zhì)的工藝優(yōu)化，改變其次級代謝方向，可使促其提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。正是這些豐富的代謝產(chǎn)物，使紅曲擁有極高的研究價值，在微生物開發(fā)與利用發(fā)展史上占有重要地位。

圖1 莫納可林K結(jié)構(gòu)式[3]Fig.1 Chemical structures of Monacolin K[3]

圖2 酸式莫納可林K結(jié)構(gòu)式[3]Fig.2 Chemical structures of Monacolin K hydroxy acid[3]

3 MK的生物合成

MK是由紅曲霉聚酮化合物合成酶（polyketides，PKS）合成的次級代謝產(chǎn)物。其有2條生物合成途徑[12]見圖3：一條在合成過程過程中形成中間體，進一步轉(zhuǎn)化為莫納可林 L（Monacolin L）、莫納可林 J（Monacolin J），最后形成MK；另一條在合成過程中形成二甲基丁酰輔酶A，進一步合成MK。

為提高紅曲MK產(chǎn)量，一些與紅曲霉MK生物合成基因簇有關(guān)的基因成為了研究熱點。通過對MK生物合成相關(guān)基因進行鑒定，研究者[13]發(fā)現(xiàn)了9個和洛伐他汀生物合成基因同源性較高的基因簇（圖4），推測它們編碼MK蛋白質(zhì)的合成基因：mokA和mokB用于合成肽鏈骨架；P450單氧酶基因（mokC），氧化還原酶基因（mokD），脫氫酶基因（mokE），轉(zhuǎn)酯酶基因（mokF），HMG-CoA 還原酶基因（mokG），轉(zhuǎn)錄因子基因（mokH）及外排泵基因（mokI）。

將mokA基因破壞后[14]，菌株不再產(chǎn)生MK，表明mokA編碼與MK生物合成相關(guān)的PKS基因；將mokB基因破壞后[15]，菌株不再產(chǎn)生MK，且Monacolin J含量升高，表明mokB編碼側(cè)鏈多肽部分的PKS生物合成基因；mokH基因編碼Zn（II）2Cys6雙核DNA結(jié)合蛋白，研究表明[16]，mokH可以上調(diào)MK生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，促進MK的產(chǎn)生。

圖3 Monacolin K的生物合成途徑[12]Fig.3 Monacolin K biosynthetic pathway[12]

圖4 Monacolin K的生物合成基因簇[13]Fig.4 Monacolin K biosynthetic gene cluster[13]

4 降脂紅曲的發(fā)酵工藝質(zhì)控點

紅曲發(fā)酵是多因素共同作用的綜合性發(fā)酵，其發(fā)酵合成MK受多種因素影響，如菌種、接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基及其營養(yǎng)組成、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH值等。固體發(fā)酵則更為復(fù)雜，除上述幾種因素外，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)、發(fā)酵基質(zhì)初始含水量及翻曲均對紅曲固體發(fā)酵合成MK有較大影響。

4.1 菌種篩選

目前，可采用紫紅曲菌、橙色紅曲菌、叢毛紅曲菌、血紅紅曲菌[17]或兩種紅曲菌混合發(fā)酵[18]來促進MK的合成。但是，并非所有的紅曲菌都具有MK合成能力，因此篩選一株具有MK產(chǎn)生能力的紅曲菌株是發(fā)酵試驗的關(guān)鍵。在自然分離篩得具有MK產(chǎn)生能力紅曲菌株的基礎(chǔ)上結(jié)合菌株改造是得到高產(chǎn)菌株的有效方法：如李桂航等[19]使用雙滅活原生質(zhì)體融合方法成功選育出紅曲霉洛伐他汀高產(chǎn)菌株；此外，利用紫外、射線或化學(xué)誘變劑，均有可能獲得高產(chǎn)紅曲突變株。某些經(jīng)過誘變的菌株在獲得高產(chǎn)MK能力的同時，也可能喪失桔霉素產(chǎn)生能力[20]，一舉兩得，可大大提高發(fā)酵物安全性。但由于霉菌菌絲體存在異核現(xiàn)象，誘變并非全部核發(fā)生變異，再次培養(yǎng)時，正突變結(jié)果難以保持，為試驗重復(fù)性帶來一定困難[21]。近年來，隨著對洛伐他汀生物合成途徑及其分子生物學(xué)認識的逐步深入，使用基因工程手段改造菌株，提高紅曲洛伐他汀的產(chǎn)量成為可能[22]。

4.2 接種量的選擇

接種量是指接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)物的體積：接種量過高，菌株生長迅速，營養(yǎng)利用較快，發(fā)酵可利用營養(yǎng)不足，導(dǎo)致發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量受限；接種量過低，菌株生長緩慢，發(fā)酵周期延長。另外，最適接種量會隨培養(yǎng)基營養(yǎng)成分變化而變化[23]且對固體發(fā)酵而言，接種會引入發(fā)酵基質(zhì)水分。因此，選擇合適的接種量對紅曲發(fā)酵產(chǎn)MK有較大影響，研究表明，接種量5%時能明顯促進MK合成[24]。

4.3 發(fā)酵溫度的選擇

紅曲菌能夠在較大溫度范圍內(nèi)（25℃～40℃）生長，但利于其發(fā)酵合成MK的溫度卻相對較為苛刻。研究表明[25]，在30℃培養(yǎng)6天后，25℃培養(yǎng)15 d的變溫培養(yǎng)條件下，其菌絲量低于30℃恒溫培養(yǎng)組，但其MK產(chǎn)量比恒溫條件高16倍。這是由于25℃的培養(yǎng)條件更利于MK合成基因簇的表達及與次級代謝有關(guān)蛋白的表達，抑制了菌絲生長蛋白的表達。Tao Huang等[26]則發(fā)現(xiàn)，高溫條件更利于某些色素合成基因簇的表達，促進部分色素合成。

4.4 發(fā)酵pH值的選擇

紅曲菌嗜酸，其生長最適pH值范圍為3.5～5。較低的pH值能夠抑制雜菌生長，維持紅曲菌優(yōu)勢生長環(huán)境，但同時可能造成紅曲細胞數(shù)量過多增殖而導(dǎo)致桔霉素產(chǎn)量升高，如CHUN-LIN LEE等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值降至2.5時，紅曲細胞量增加，其MK及桔霉素產(chǎn)量均升高；當(dāng)pH值升至5.7時，其MK產(chǎn)量較對照組提高了47%，桔霉素產(chǎn)量降低了54%。BiyuKang等[28]則發(fā)現(xiàn)氮源直接影響發(fā)酵終點的pH值變化，而pH值變化又進一步影響紅曲菌某些次級代謝產(chǎn)物的合成，因此通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的氮源添加比例來控制發(fā)酵pH值變化，可調(diào)控菌株的次級代謝進程。Bibhu Prasad Panda等[29]在進行發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對多種工藝參數(shù)均有促進作用。因此，加強對發(fā)酵pH值動態(tài)變化監(jiān)測，探究其變化對紅曲基因表達的影響，是調(diào)控紅曲菌次級代謝的重要研究方向。

4.5 固體發(fā)酵初始含水量的選擇

水是紅曲菌菌絲生長、孢子形成及次級代謝產(chǎn)物合成必不可少的物質(zhì)，選擇適宜的初始含水量既有利于菌株生長代謝，又能避免由于發(fā)酵后期補水造成的染菌風(fēng)險。含水量的選擇對發(fā)酵狀態(tài)影響較大：初始含水量過高，菌絲旺盛生長，基質(zhì)結(jié)塊難以疏散，不利于氧氣傳遞、廢氣排出，阻礙菌株生長及MK合成；初始含水量過低，物料干硬，不利于菌株生長及酶系傳遞。Fusheng Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始含水量控制在55%～75%時，菌株發(fā)酵的MK產(chǎn)量相對較高。另外國藥集團健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司實驗室在紅曲發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，菌株在生長代謝消耗基質(zhì)中的營養(yǎng)，基質(zhì)保水能力下降，在發(fā)酵中后期會產(chǎn)生游離水。發(fā)酵游離水的產(chǎn)生會使底部基質(zhì)長期泡在液體中，溶氧極差且濕度過高粘于瓶壁不易翻曲，不利于菌株生長及發(fā)酵。因此，如何選擇最優(yōu)初始含水量，控制游離水產(chǎn)生，也是提高紅曲固體發(fā)酵MK產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

4.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

現(xiàn)階段的紅曲發(fā)酵主要以固體發(fā)酵及液體發(fā)酵為主，兩種發(fā)酵方式各有其特色。紅曲固體發(fā)酵，主要指將紅曲菌接種于不含或僅含有少量水的固態(tài)基質(zhì)如大米、小米等，進行的一種發(fā)酵。研究表明[20]，紅曲固體發(fā)酵過程中，細胞生長、甘油消耗及MK的產(chǎn)生均比液體發(fā)酵快；固體發(fā)酵基質(zhì)細胞膜流動性和滲透性比液體發(fā)酵好；且固體發(fā)酵基質(zhì)構(gòu)成了一個碳源濃度梯度微環(huán)境[31]，可減少代謝阻遏，利于菌株生長及產(chǎn)物合成。但是固體發(fā)酵工藝復(fù)雜，為紅曲工業(yè)化生產(chǎn)帶來一定困難。紅曲液體發(fā)酵周期短、污染率小、易控制，但MK產(chǎn)量普遍低且后處理成本高。

4.6.1 固體發(fā)酵底物及附加營養(yǎng)的選擇

紅曲固體發(fā)酵最常使用的發(fā)酵底物為大米，其較高的淀粉含量及較好的保濕性很適合紅曲菌生長及代謝產(chǎn)物合成。另外，除使用單一大米作為發(fā)酵底物外，也可使用其他物質(zhì)代替大米或復(fù)配大米作為發(fā)酵底物，提高MK的產(chǎn)量：Burcu Atll等[32]認為，使用粒度為1 mm～2 mm的大麥作為固體發(fā)酵基質(zhì)，既能滿足菌株生長代謝的營養(yǎng)需求，又能提高溶氧，經(jīng)工藝優(yōu)化后，MK 產(chǎn)量可達 139.47 mg/g；Patcharee Pattanagul等[33]選用具有多種藥用價值的薏仁作為發(fā)酵基質(zhì)，在篩得高產(chǎn)MK菌株的同時，該菌株發(fā)酵物中的桔霉素含量明顯下降；N.Jaivel等[34]使用疏松且富含豐富礦物質(zhì)及微量元素的麥麩作為發(fā)酵基質(zhì)，能夠獲得比高粱基質(zhì)、玉米基質(zhì)、米糠基質(zhì)更高產(chǎn)量的MK；Rashmi Dikshit等[16]也發(fā)現(xiàn)，使用麥麩作為發(fā)酵基質(zhì)能夠獲得比多種水果種子基質(zhì)及米糠基質(zhì)更高產(chǎn)量的MK。除上述幾種基質(zhì)外，還可使用其他工業(yè)或農(nóng)業(yè)廢料[35]作為發(fā)酵基質(zhì)，既能降低成本、提高利用價值，又可以保護環(huán)境，是紅曲固體發(fā)酵的一個新研究方向。

營養(yǎng)成分影響菌絲生長、孢子萌發(fā)、細胞增殖及菌落形態(tài)變化。在選擇合適發(fā)酵基質(zhì)的基礎(chǔ)上，附加一定量營養(yǎng)物質(zhì)，是提高發(fā)酵MK產(chǎn)量的重要策略。Jirasatid等[36]使用響應(yīng)面優(yōu)化試驗篩得一較優(yōu)發(fā)酵工藝：在使用大米作為基礎(chǔ)發(fā)酵基質(zhì)的基礎(chǔ)上，附加2%甘油、0.14%甲硫氨酸和0.01%硝酸鈉，發(fā)酵MK產(chǎn)量可得5 900 mg/kg，且在此工藝下其黃色素產(chǎn)量也有較大提升，桔霉素產(chǎn)量下降；Fusheng Chen等[30]在使用大米混合少量麥麩發(fā)酵基質(zhì)基礎(chǔ)上，附加一定量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（葡萄糖、谷氨酸鈉、蛋白胨、硝酸銨、磷酸二氫鉀），對MK的合成有明顯促進作用；Bo-BoZhang等[37]使用小粒徑且低黏度的小米作為發(fā)酵基質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上附加20%甘油及3.5%豆粕，其發(fā)酵MK產(chǎn)量最高可達19.81 mg/g。

4.6.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

紅曲液體發(fā)酵是一個不斷變化的發(fā)酵過程，隨著菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，發(fā)酵液中會發(fā)生一系列pH值[38]及氧化還原電位[39]的變化，這些變化會調(diào)控某些與紅曲次級代謝有關(guān)的基因簇，影響代謝產(chǎn)物的合成。與固體發(fā)酵相比，對液體發(fā)酵進行營養(yǎng)組分優(yōu)化更簡便可行，選擇合適的營養(yǎng)因子并加以優(yōu)化，是提高紅曲液體發(fā)酵MK產(chǎn)量的有效方法。

甘油是紅曲發(fā)酵中常用的營養(yǎng)物質(zhì)，其既可以作為碳源供菌株生長利用，又可以作為發(fā)酵前體因子，刺激菌株MK合成。添加適量甘油能夠促進MK合成，但高濃度甘油會抑制某些MK合成相關(guān)基因的表達，不利于MK生產(chǎn)[40]。Subhagar Seraman等[41]通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、蛋白胨、硫酸錳、氯化鈉、氯化銨均對MK合成有較大影響，經(jīng)工藝優(yōu)化后，發(fā)酵14 d時MK產(chǎn)量可達97.5 mg/L；Yaw-Nan Chang等[42]對米粉、葡萄糖、甘油、蛋白胨進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，篩得一較優(yōu)工藝，驗證后其MK產(chǎn)量可達131.0 mg/L；Sadik Ali Sayyad等[43]對葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳5個參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化后MK產(chǎn)量可達351mg/L；Chan Zhang等[44]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸可以上調(diào)部分MK合成基因表達，促進細胞中MK分泌，經(jīng)工藝優(yōu)化后，MK產(chǎn)量提高了3.5倍；Jun Zhang等[45]通過添加MK合成前體檸檬酸鈉后，產(chǎn)量提高了52.6%；添加能夠增強細胞膜通透性的表面活性劑Triton X-100后，產(chǎn)量較對照組提高了86.9%。

5 展望

隨著對降脂紅曲的深入探索，其未來的可研究熱點包括：1）加強對菌株基因工程改造的研究，提高菌株MK產(chǎn)生能力；2）在提高紅曲菌發(fā)酵MK產(chǎn)量的同時，提高其他活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量并加強代謝產(chǎn)物安全性研究：如Jing Huang等[46]研究發(fā)現(xiàn)，亞油酸作為一種信號分子能夠促進MK合成基因的表達，提高MK產(chǎn)量，與此同時，低濃度的亞油酸也有利于紅曲色素的產(chǎn)生；Jyh-Jye Wang等[47]對發(fā)酵溫度、水分及乙醇添加量進行工藝優(yōu)化后，發(fā)酵的MK、γ-氨基丁酸產(chǎn)量均提升且桔霉素產(chǎn)量下降；Yuan-Chi Su等[48]在篩得高產(chǎn)MK菌株的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵組分營養(yǎng)優(yōu)化，在優(yōu)化后的工藝下，MK及γ-氨基丁酸產(chǎn)量均提高。因此，在進行紅曲工藝優(yōu)化的同時，提高其兩種或多種次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，控制桔霉素產(chǎn)生，能夠大大提高試驗效率及紅曲產(chǎn)品安全性，是紅曲發(fā)酵新的研究方向；3）在降脂紅曲的基礎(chǔ)上，研究紅曲新的活性方向：如紅曲除熟知的降壓降脂等生物活性外，其還可作為一種自由基清除劑[49]，發(fā)揮抗氧化活性；最新研究表明紅曲還具有抗癌活性[50]：其可以阻滯腫瘤細胞的正常生長、抑制腫瘤細胞形成、促進腫瘤細胞凋亡從而發(fā)揮抗癌作用。但是關(guān)于其抗癌機制還待進一步深入研究。