Toll樣受體7介導(dǎo)抗流感病毒免疫反應(yīng)研究進(jìn)展

史玉聰，許華沖，陳孝銀

(暨南大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510632)

Toll樣受體是機(jī)體識(shí)別病原體的主要固有免疫受體[1-2]。不同類型的TLRs(Toll-like receptors，TLRs)識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)[3]，在抗病毒中發(fā)揮不同的作用。最新研究表明外來抗原的持續(xù)作用使Toll樣受體脫敏，避免和緩解自身免疫疾病[4]。到目前發(fā)現(xiàn)TLR家族共包括13名成員，即TLR1～TLR13。其在體內(nèi)有各自的生理特征及表達(dá)位置，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表達(dá)于免疫細(xì)胞表面；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。其中TLR7可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬從而介導(dǎo)流感病毒的進(jìn)展外，也可通過MyD88信號(hào)依賴型通路調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的相關(guān)免疫反應(yīng)，從而參與調(diào)控流感病毒侵襲人體的發(fā)生發(fā)展過程。

1 TLR7的來源

1988年Hashimoto等在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)決定背腹側(cè)分化的基因，將其命名為Toll基因[5]。1994年，Nomuria等在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白，這種蛋白胞膜外結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸的重復(fù)序列，與果蠅Toll蛋白結(jié)構(gòu)相似[6]。Taguchi等克隆并定位編碼這種蛋白的基因，也就是TLR1。TLR1成為人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)果蠅Toll蛋白的同源物[7]。Lemaitre等發(fā)現(xiàn)在果蠅對真菌感染的免疫中Toll起著重要作用，從而確立了Toll的免疫學(xué)意義[8]。一年后，另一個(gè)哺乳動(dòng)物Toll樣受體(TLR4)的同源物被證明誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[9]。Du等于2000年在人類基因組數(shù)據(jù)庫中，找到3個(gè)與MyD88高度同源序列，經(jīng)過克隆得到3個(gè)新的人類TLRs基因，分別命名為TLR7、TLR8和TLR9[10]。從此展開了對TLR7的一系列研究。

TLR7是Toll樣受體家族中的重要成員之一，基因存在于人類X染色體上第30065號(hào)基因，編碼的成熟蛋白肽鏈含1022個(gè)氨基酸[11]，位于巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、呼吸道神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)體表面等。TLR7表達(dá)于細(xì)胞的內(nèi)溶酶體中[12]，是一種能夠識(shí)別病毒單鏈RNA(ssRNA)的受體和某些小分子抗病毒化合物。TLR7蛋白屬于I型跨膜蛋白，主要有胞外區(qū)，跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)，主要功能是識(shí)別相應(yīng)配體，胞內(nèi)區(qū)是一段高度保守序列，其功能主要是與下游接頭分子形成復(fù)合物，將信息傳遞到核內(nèi)[13]。

2 TLR7介導(dǎo)的MyD88依賴性信號(hào)通路

TLR7識(shí)別病毒相關(guān)ssRNA病毒感染后，通過激活骨髓分化因子88(MyD88)招募下游的信號(hào)事件，NF-κB是TLR7介導(dǎo)的MyD88依賴性信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子，TLR7信號(hào)通路活化后，NF-κB抑制物IKB降解，解除對NF-κB的抑制作用，游離的NF-κB轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫受體、酶等發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)[14]。Wei等證實(shí)在H5N1感染期間，TLR7的MyD88依賴性途徑參與了鵝的流感病毒先天免疫應(yīng)答的早期階段[15]。

近年來對中藥抗流感的研究較多，其中關(guān)于TLR7介導(dǎo)的MyD88依賴性信號(hào)通路的研究顯示，該通路通過減輕炎癥反應(yīng)緩解病情。黃芪多糖通過TLR4/7-MyD88-NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低肺組織的炎性反應(yīng)，發(fā)揮抗流感病毒感染的作用。治療和預(yù)給藥的方式均能緩解流感病毒誘導(dǎo)的肺炎性病理損傷，發(fā)揮抗流感病毒感染的作用[16]。銀翹散、清熱透表方能通過抑制TLR7信號(hào)通路的激活，下調(diào)下游因子MyD88，來降低炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而減輕肺部病理損傷[17-18]。梓醇抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞通過下調(diào)TLR7、MyD88、NF-κB和PLA2，可減輕流感相關(guān)的過度免疫反應(yīng)[19]。漢黃芩素對流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位抑制作用，降低NF-κB蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而降低炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕肺損傷[20]。

3 與TLR7相關(guān)的抗流感病毒免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制

TLR7在誘導(dǎo)抗流感病毒感染的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，然而TLR7在抗流感病毒免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制及TLR7缺失對機(jī)體的具體影響機(jī)制尚不清楚。Lemaitre等研究表明天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)激活TLR7控制的抗甲型流感病毒(AIV)的免疫應(yīng)答[21]。AEP活性對TLR7加工是至關(guān)重要的，TLR7需要AEP的蛋白水解切割以產(chǎn)生能夠發(fā)信號(hào)的C端片段。AEP缺陷小鼠的抗IAV免疫應(yīng)答減弱，表現(xiàn)為細(xì)胞相關(guān)抗原交叉表達(dá)水平和IAV誘導(dǎo)的TLR7依賴性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生水平的降低，以及炎癥減輕。Jeisy-Scott等研究表明在流感病毒感染的體液免疫應(yīng)答中，TLR7信號(hào)傳導(dǎo)是通過骨髓來源的抑制細(xì)胞(MDSC)的募集來實(shí)現(xiàn)的，MDSC在TLR7基因敲除小鼠的肺中積累比在野生型C57Bl/6小鼠中更多，并且促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)，與野生型小鼠的CD4+T細(xì)胞相比，TLR7基因敲除小鼠Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，導(dǎo)致Th2偏倚反應(yīng)[22]。表明TLR7在小鼠IAV感染過程中可以調(diào)節(jié)MDSC的積累，在小鼠缺失TLR7的情況下增加了MDSC積累和對Th2的偏倚反應(yīng)。Blasius等認(rèn)為TLR7和TLR9的激活通過募集IRAK(IL-1受體[IL-1R]相關(guān)的激酶)介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)MyD88的募集，在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)中存在另外的途徑，TLR7和TLR9通過MyD88直接通過轉(zhuǎn)錄因子IRF7誘導(dǎo)大量的IFN表達(dá)[23]。Pang等的研究表明CD8+T細(xì)胞對正常滴度的IAV反應(yīng)的激活并不依賴于TLR7和RIG-I下游的組合信號(hào)，而是依賴于炎癥小體IL-1β和IL-1R/MyD88。流感病毒感染細(xì)胞后，通過TLR7與RIG-I信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，招募了大量易被IAV感染的靶細(xì)胞到呼吸道，從而增強(qiáng)呼吸道內(nèi)的病毒載量[24]。Hipp等認(rèn)為弗林樣蛋白轉(zhuǎn)化酶在人類TLR7分子的加工和累積過程中發(fā)揮了重要作用，它可減少TLR7依賴性自身免疫病的發(fā)生，并作為免疫病理的可能靶標(biāo)[25]。Kaminski等得到類似的結(jié)論認(rèn)為，pDC可能通過來自TLR7的信號(hào)有助于保護(hù)肺免受IAV感染[26]。有研究認(rèn)為病毒可激活pDC的TLR7和TLR3信號(hào)通路產(chǎn)生β-干擾素，進(jìn)而減輕腸道炎癥，啟動(dòng)機(jī)體抗病毒及抗炎的免疫應(yīng)答過程[27]。

4 TLR7與流感病毒引起的炎癥風(fēng)暴

流感病毒引起人呼吸道感染，導(dǎo)致普遍流行性，發(fā)病率和死亡率普遍較高，但也因類型不同而各異。與甲型H1N1亞型和乙型流感病毒相比，甲型H3N2亞型流感病毒有著更高的發(fā)病率和致死率[28]。感染H9N2亞型流感病毒的患者通常僅有輕微的上呼吸道感染癥狀，甚至不出現(xiàn)任何癥狀，H5N1亞型流感病毒感染患者癥狀重、起病急，大都會(huì)在發(fā)病初期出現(xiàn)高熱、咳嗽、氣急、頭痛、肌肉酸痛和全身不適等癥狀[29]。機(jī)體感染流感病毒后“細(xì)胞因子”效應(yīng)所誘導(dǎo)的適度的免疫反應(yīng)是有益的，但是如果誘導(dǎo)過度演變成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇悦庖叻磻?yīng)，造成肺組織的炎性損傷和自身細(xì)胞的破壞。在感染H5N1禽流感病毒的患者體內(nèi)觀察到的細(xì)胞因子風(fēng)暴現(xiàn)象被普遍認(rèn)為是促炎性細(xì)胞因子的過度或失控釋放[30]。多項(xiàng)研究表明流感病毒引起的炎癥風(fēng)暴是通過TLR7途徑實(shí)現(xiàn)的。To等首次證明了IAV可以通過激活小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的TLR7信號(hào)通路，促進(jìn)NADPH氧化酶2(NOX2)氧化爆發(fā)，引起急性肺損傷[31]。有研究認(rèn)為MALT1在肺泡巨噬細(xì)胞中有調(diào)節(jié)TLR7激動(dòng)劑和IAV誘導(dǎo)的MMP-9免疫應(yīng)答作用，MALT1在TLR7刺激后介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中CYLD的減少，肺泡巨噬細(xì)胞中MMP-9的產(chǎn)生是通過NF-κB實(shí)現(xiàn)的，而MALT1缺陷可降低IAV感染的嚴(yán)重程度，這說明了MALT1在調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞MMP-9的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，其存在加劇了流感的嚴(yán)重程度[32]。Makni-Maalej等認(rèn)為，TLR7/8激動(dòng)劑CL097通過介導(dǎo)人嗜中性粒細(xì)胞選擇性位點(diǎn)中的p47phox的磷酸化，導(dǎo)致NADPH氧化酶的超活化，合并激活p38MAPK、ERK1/2通路進(jìn)而產(chǎn)生過量的過氧化物產(chǎn)生引起炎癥風(fēng)暴[33]。

5 TLR7佐劑研發(fā)的流感疫苗

接種疫苗是預(yù)防和控制流感病毒感染最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。開發(fā)病毒保守表位的新抗原，而不是病毒血凝素HA高度可變的抗原區(qū)域，以及增強(qiáng)疫苗抗原性和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的佐劑，是一條更有指導(dǎo)意義的思路[34-37]。近年來，根據(jù)TLR7介導(dǎo)的流感病毒免疫反應(yīng)機(jī)制，通過激活TLR7信號(hào)通路來刺激先天免疫應(yīng)答成為研究趨勢。Zhang等研發(fā)的ILR7激動(dòng)劑咪喹莫特聯(lián)合流感疫苗可以促進(jìn)和增強(qiáng)BALB/c小鼠抗IAV pdm09的體液免疫應(yīng)答[14]。陳婷婷等利用自主研發(fā)的新型TLRs7小分子激動(dòng)劑SZU-101(T7)與流感病毒偶聯(lián)形成Flu-T7疫苗可以有效地增強(qiáng)H1N1流感病毒滅活疫苗的免疫效果，并且對小鼠低毒性，SZU-101可以作為H1N1流感病毒滅活疫苗的一種安全有效的佐劑[38]。Goff等合成TLR4和TLR7配體結(jié)合的重組流感病毒血凝素作為一種有效的佐劑，可誘導(dǎo)快速和持久的免疫力，對抗流感病毒的不同亞型起作用[39]。Fujita等開發(fā)的一種針對TLR7/8的自我佐劑肽疫苗的新型高效疫苗，是基于TLR7/8配體結(jié)構(gòu)，合成一系列氨基酸6-咪唑并喹啉基-正亮氨酸的疫苗，其在Lys的ε-NH2基團(tuán)上構(gòu)建了與TLR7/8激動(dòng)劑藥效基團(tuán)一樣的咪唑并喹啉結(jié)構(gòu)。將IAV M2e抗原與TLR7/8激動(dòng)劑氨基酸混合或共價(jià)綴合作用于小鼠，在不存在其他佐劑的情況下可誘導(dǎo)M2e特異性抗體的產(chǎn)生[9]。與TLR7激動(dòng)劑相比，TLRs7/8激動(dòng)劑小分子的特點(diǎn)使得它們代謝快速、起效窗口期較短，往往造成藥效不一致。而在新型TLRs7/8激動(dòng)劑的開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)采用偶聯(lián)型TLRs7/8合成的蛋白-TLRs7/8復(fù)合體疫苗則具有顯著的免疫保護(hù)效果[40]。Jeisy-Scott等研究表明，TLR7基因敲除小鼠的生發(fā)中心形成后，其抗體分泌細(xì)胞和循環(huán)流感病毒特異性抗體水平顯著降低，在受到流感病毒攻擊時(shí)未能形成保護(hù)性免疫記憶[41]。

6 展望

流感病毒在全球流行，找到有效的防制措施迫不及待。TLR7信號(hào)傳導(dǎo)依賴于核內(nèi)體酸化傳導(dǎo)[12]，并通過識(shí)別核內(nèi)體或溶酶體中的ssRNA，導(dǎo)致炎癥和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的分泌，GU序列存在于病毒以及宿主內(nèi)源性RNA中，所以TLR7不能區(qū)分“外源的”和“自身的”RNA，除非存在GU頻率或RNA堿基修飾的差異[42]。某些合成化合物：咪唑奎諾酮和雷西莫特是TLR7和TLR8的配體，然而有研究表明鳥苷類似物也能活化TLR7[43]。RNA被普遍存在的細(xì)胞外核酶(RNases)快速降解，以至于極少的自體ssRNA到達(dá)抗原呈遞細(xì)胞，因此缺乏TLR7識(shí)別的特異性ssRNA基因序列。針對TLR7的這些缺點(diǎn)，有研究試圖基于寡核苷酸改進(jìn)RNA的核酸酶穩(wěn)定性，以此增強(qiáng)TLR7和/或TLR8的免疫調(diào)節(jié)活性[44]。Steed等研究表明類黃酮經(jīng)腸道菌-梭狀芽胞桿菌代謝的產(chǎn)物脫氨基酪氨酸，并不能阻止流感病毒的傳染，但可以阻止免疫系統(tǒng)對肺部組織的傷害，提供了一種治療流感的新思路[45]。有研究表明腸道菌群失調(diào)加重流感病毒引起的組織病理改變，通過激活LPS/TLR4通路，從而上調(diào)小鼠肺組織流感病毒所致的炎性因子應(yīng)答水平[46]。另外，腸道厭氧菌失調(diào)小鼠體內(nèi)存在明顯的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，肺組織內(nèi)Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞因子參與菌群失調(diào)小鼠流感病毒感染后引起的肺組織的免疫病理損傷[47]。我們的前期研究認(rèn)為流感病毒感染能引起小鼠腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-κB等的mRNA表達(dá)水平的變化，并發(fā)現(xiàn)相關(guān)中草藥可通過調(diào)節(jié)腸道菌群恢復(fù)機(jī)體的正常免疫應(yīng)答以達(dá)到抗病毒作用[48-51]。當(dāng)受到流感病毒感染時(shí)，腸道菌群失調(diào)會(huì)抑制TLR7信號(hào)通路活化，益生菌治療后，可以恢復(fù)TLR7信號(hào)通路的正常表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗流感病毒的作用。因此，從腸道菌群入手結(jié)合TLR7信號(hào)通路探討抗流感病毒的相關(guān)機(jī)制，或可為防治流感提供新的有效途徑。