6個枇杷品種對低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性評價

潘翠萍 謝紅江 王永清 張卉 鄧群仙 楊志武 文露 何珊珊

摘? 要? 為探究枇杷對低溫脅迫的生理響應(yīng)，綜合評價不同枇杷品種的抗寒能力，本研究以6個枇杷品種為試驗材料，研究了低溫脅迫對枇杷幼果種胚相對電導率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化。結(jié)果表明：隨處理溫度的降低，各枇杷品種幼果種胚相對電導率REC呈現(xiàn)“小大小”的“S”型曲線變化，結(jié)合Logistic方程得出不同枇杷品種種胚的半致死溫度介于4.759 ～ 2.73 ℃之間，其中，WT（白肉芽變）幼果種胚的半致死溫度最低，大五星幼果種胚的半致死溫度最高;6個枇杷品種的脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量隨低溫脅迫均呈現(xiàn)出先升高后降低的倒“V”型變化趨勢，但增幅和達到峰值的時間點不同;可溶性糖和可溶性蛋白含量呈逐漸增加的趨勢，均在5 ℃時達到最大值;通過隸屬函數(shù)綜合分析，得出6個枇杷品種材料的抗寒能力表現(xiàn)為WT（白肉芽變）>冠玉>寧海白>龍泉5號>早鐘6號>大五星。綜上所述，WT（白肉芽變）對低溫的脅迫具有較強的適應(yīng)性，抗寒能力強;半致死溫度LT50結(jié)合隸屬函數(shù)法的綜合評價能準確鑒定枇杷品種的抗寒性。本研究為枇杷抗寒種質(zhì)的篩選及尋找提高抗寒性的新途徑提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 枇杷;低溫脅迫;生理響應(yīng);抗寒性;評價

中圖分類號? S667.3? ? ? 文獻標識碼? A

Physiological Responses and Evaluation of Cold Resistance under Cold Stress for Six Varieties of Eriobotrya japonica （Thunb.）

PAN Cuiping1， XIE Hongjiang2， WANG Yongqing1*， ZHANG Hui1， DENG Qunxian1， YANG Zhiwu1，

WEN Lu1， HE Shanshan1

1. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Wenjiang， Sichuan 611130， China; 2. Horticulture Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China

Abstract? In order to investigate the physiological response and comprehensively assess cold resistance of different varieties under low stress， six varieties of Eriobotrya japonica （Thunb.） under cold stress were analyzed to determine the dynamic changes of relative electric conductivity （REC）， malonadehyde （MDA）， free proline （Pro）， soluble sugar and soluble protein. The results showed that the relative electric conductivity （REC） in vitro seed embryos of young fruits of six loquat varieties presented an ‘S type curve change pattern as temperature decreased. The semi-lethal temperature of the six loquat varieties ranging from 4.759 to –2.73 ℃ using logistic equation， the semi-lethal temperature of white bud mutation was the highest and the Dawuxing loquat was the lowest among them. The contents of free proline （Pro） and malonadehyde （MDA） presented an inverted “V” type curve change pattern with the different time point of reaching the peak， which generally increased first and then decreased under cold stress. Furthermore， the soluble sugar and soluble protein increased as temperature decreased with the maximum value was obtained at the time of 24 h when treated at 5 ℃. The cold resistance ability of the six loquat varieties evaluated as WT （white bud mutation） > Guanyu > Ninghaibai > Longquan No.5 > Zaozhong No.6 > Dawuxing. In conclusion， the WT （white bud mutation） showed strong adaptability to low temperature stress and strong cold resistance. The median-lethal temperature combined with comprehensive evaluation based on subordinate function analysis could accurately identify the cold resistance of loquat varieties， which would provide a theoretical foundation and reference for screening of cold materials and looking for a new approach to increase the cold hardiness of loquat.

Keywords? loquat （Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）; cold stress; physiological responses; cold resistance; evaluation

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.009

枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）隸屬于薔薇科（Rosaceae）枇杷屬（Eriobotrya），是我國南方主要經(jīng)濟樹種和名貴特產(chǎn)果樹之一[1-2]，枇杷原產(chǎn)我國西南（四川雅安境內(nèi)大渡河流域），已有2100多年的栽培歷史;我國是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[3-4]。四川是枇杷的栽培大省，栽培面積4萬hm2，產(chǎn)量40萬t，其栽培面積和產(chǎn)量均居全國第一。枇杷已成為四川最具特色和競爭優(yōu)勢的亞熱帶果品之一，在推動四川盆周山區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收致富中占有重要地位[5]。

枇杷秋萌冬花，春實夏熟，以幼果越冬，極易遭受凍害[6-8]。據(jù)統(tǒng)計，四川枇杷產(chǎn)區(qū)在2008— 2018年間因低溫造成減產(chǎn)的面積超過總栽培面積的60%，嚴重影響枇杷產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)，2016年全省枇杷受凍面積達90%以上，幾近絕收。凍害已成為一些產(chǎn)區(qū)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要制約因素，嚴重影響了果農(nóng)的經(jīng)濟效益[9]。

前人對枇杷抗寒性研究多以葉片和果實為研究材料[10-12]，以幼果種胚為研究材料的較少，且前人多采用離體脅迫的方式[13]，以整個植株為脅迫對象的較少[14];然而，枇杷幼果受凍表現(xiàn)為種子最先受凍褐變，進而引起幼果受凍致死。因此，研究種胚在低溫脅迫下的生理響應(yīng)對于準確評價枇杷材料的抗寒性能具有重要意義。本研究分析了6個枇杷品種幼果種胚在低溫脅迫下的生理響應(yīng)，采用隸屬函數(shù)法對其抗寒性能進行了綜合評價，以期為枇杷抗寒新品種的選育及尋找提高枇杷抗寒性的新途徑提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試的6個枇杷品種分別為冠玉、寧海白、大五星、龍泉5號、早鐘6號，WT（白肉芽變），所有材料均為3年生盆栽嫁接苗，砧木為解放鐘;選擇長勢基本一致，高度為80～90 cm、幼果直徑大小為1.2～1.3 cm的掛果盆栽為試材。

1.2? 方法

1.2.1? 低溫脅迫? 將盆栽苗進行梯度降溫后（降溫速度為4 ℃/h），分別進行不同溫度（3 ℃、1 ℃、1 ℃、3 ℃、5 ℃），每個溫度梯度均處理24 h，以25 ℃為對照，1 ℃處理置于人工氣候箱（光照時間9 h/d，光照強度為3000 lx，空氣濕度60%）。1 ℃、3 ℃、5 ℃處理置于低溫植物培養(yǎng)箱中進行（其精確度為±1 ℃，空氣濕度、光照時間和強度同人工氣候箱處理相一致），每個溫度梯度處理5盆，重復3次。盆栽苗經(jīng)預設(shè)低溫處理后室溫恢復12 h，分別選取不同處理后直徑大小為1.2～1.3 cm幼果，手術(shù)刀冰面上迅速切取幼果種胚，液氮速凍后超低溫保存進行相關(guān)生理指標測定。

1.2.2? 半致死溫度LT50的測定? 相對電導率的測定方法參照賴靜[9]的方法進行，REC和Logistic方程配合，計算種胚的半致死溫度LT50[15]。

1.2.3? 生理指標的測定? 細胞膜透性采用電導率法，REC和Logistic方程配合，計算種胚的半致死溫度LT50;丙二醛（MDA）的測定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶（SOD）測定采用抑制光化還原法;過氧化氫酶（CAT）測定采用高錳酸鉀滴定法;過氧化物酶（POD）測定采用愈創(chuàng)木酚法;可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法測定;可溶性蛋白（SP）含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.2.4? 抗寒性綜合評價? 采用隸屬函數(shù)法綜合各項指標對枇杷材料進行抗寒性評價[16]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 低溫脅迫下枇杷幼果種胚的相對電導率變化與半致死溫度

隨處理溫度的降低，各枇杷品種幼果種胚相對電導率REC呈現(xiàn)“小大小”的“S”型曲線變化（圖1），不同枇杷品種對低溫脅迫的敏感性不同，當處理溫度從3 ℃降到1 ℃時，WT、冠玉、寧海白相對電導率分別增加了4.7%、7.6%、12.5%，而紅肉枇杷龍泉5號、早鐘6號、大五星相對電導率分別增加了18.7%、28.1%、36.4%。當溫度降至3 ℃時，WT、冠玉、寧海白相對電導率分別為59.32%、67.32/%、70.21%，而龍泉 5號、早鐘6號、大五星相對電導率均超過了80%，當處理溫度為5 ℃時，早鐘6號、大五星相對電導率分別為88.39%、89.54%，顯著高于其他4個品種，WT相對電導率最低，為65.21%，根據(jù)電導率大小與植物抗寒性的關(guān)系可知，WT的抗寒能力強，大五星的抗寒能力最弱。

Logistic方程擬合結(jié)果顯示，6個枇杷品種種胚相對電導率與半致死溫度LT50呈較強的線性關(guān)系，R2介于0.907～0.946之間，表明擬合結(jié)果較精確可靠，可作為枇杷抗寒性判定的重要指標（表1）。不同枇杷品種種胚的半致死溫度介于4.759～2.73 ℃之間，其中，WT幼果種胚的半致死溫度最低，抗寒能力強，大五星幼果種胚的半致死溫度最高，抗寒能力弱。

2.2? 低溫脅迫下枇杷種胚的生理響應(yīng)特征

低溫脅迫下，6個枇杷丙二醛含量呈現(xiàn)出先升高后降低的倒“V”型變化趨勢，但增幅和達到峰值的時間點不同（圖2），龍泉5號、早鐘6號、大五星丙二醛含量在處理脅迫溫度為1 ℃時達到最大值，其中大五星丙二醛含量最高，達0.92 nmol/g，冠玉、寧海白在3 ℃時達到最大值，而WT在處理溫度為5 ℃時達到最大值。在整個低溫脅迫3 ℃降到5 ℃時過程中，大五星丙二醛含量變幅最大，其次為早鐘6號，WT丙二醛變幅最小。

6個枇杷品種低溫脅迫下脯氨酸含量（圖3）變化規(guī)律與MDA類似，低溫處理初期，脯氨酸含量急劇上升，隨著處理時間延長脯氨酸含量又逐漸降低。龍泉5號、早鐘6號、大五星脯氨酸在1 ℃時達到最大值，相比3 ℃時增幅分別為92%、60.7%、75%;冠玉、寧海白、WT脯氨酸在3 ℃時達到最大值，相比3 ℃時其增幅分別為106.9%、91.6%、98.5%。WT脯氨酸含量在低溫脅迫過程中始終處于較高水平且增幅較大。

隨著處理溫度的降低，6個枇杷品種的可溶性糖含量呈逐漸增加的趨勢，均在5 ℃時達到最大值，其中早鐘6號和大五星的增幅相對較小，分別為88.3%和98.1%，而WT的可溶性蛋白增幅最大，達141.6%（圖4）。可溶性蛋白含量與可溶性糖含量具有相似的變化規(guī)律（圖5），也是隨著處理溫度的降低呈上升的趨勢，在低溫脅迫初期（3 ℃）時，可溶性蛋白含量基數(shù)白肉品種冠玉、寧海白、WT顯著高于紅肉品種龍泉5號、早鐘6號、大五星，在5 ℃時達到最大值時，可溶性蛋白含量白肉品種冠玉、寧海白、WT分別較3 ℃時增加了132.5%、111.8%、101.1%、黃肉品種龍泉5號、早鐘6號、大五星分別增加了139.3%、138.5%和166.7%。

2.3? 抗寒性綜合評價和聚類分析

采用隸屬函數(shù)法對6個枇杷的5項生理指標進行抗寒性綜合評價，結(jié)果表明（表2），WT、寧海白、冠玉、早鐘6號、龍泉5號及大五星的平均隸屬度分別為0.759、0.556、0.592、0.434、0.474、0.407，平均隸屬度綜合反映了品種抗寒能力的大小，其值越大則表明抗寒性越強。因此，

低溫脅迫下6個枇杷品種的抗寒能力大小依次為WT>冠玉>寧海白>龍泉5號>早鐘6號>大五星。

對6個枇杷的抗寒平均隸屬函數(shù)值進行聚類分析（圖6），可將6個枇杷品種分為3類。第一類：WT，抗寒能力強;第二類：冠玉>寧海白，抗寒能力中等;第三類：龍泉5號>早鐘6號>大五星，抗寒能力較弱。這與半致死溫度LT50得出的結(jié)果基本一致。

3? 討論

植物膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位，其穩(wěn)定性對于植物抵御低溫逆境具有重要意義。相對電導率的變化反應(yīng)細胞膜透性的改變，因此常作為評定植物細胞膜損壞程度的重要參考指標[17]。前人研究表明，抗寒能力強的植物低溫脅迫下植物膜系統(tǒng)穩(wěn)定性較強，相對電導率較小，反之，植物膜系統(tǒng)穩(wěn)定性較差，相對電導率較大[18]。本研究表明，隨處理溫度的降低，6個枇杷品種幼果種胚相對電導率REC呈現(xiàn)“小大小”的“S”型變化趨勢，表明各枇杷品種隨著低溫脅迫的加劇，種胚細胞膜系統(tǒng)均受到不同程度的傷害。不同枇杷品種對低溫脅迫的敏感性不同，當處理溫度為5 ℃時，大五星相對電導率最高，為89.54%，而WT相對電導率最低，為65.21%，根據(jù)電導率大小與植物抗寒性的關(guān)系可知，WT的抗寒能力最強，大五星的抗寒能力最弱，這與Logistic方程的擬合結(jié)果一致。

丙二醛可用于反映植物細胞膜傷害程度及抵御逆境能力的強弱[19-20]。令凡等[21]對低溫脅迫下油橄欖相關(guān)生理特征的變化研究表明，油橄欖抗寒性與樹體中丙二醛含量呈負相關(guān)，即抗寒性越強的植物丙二醛含量變化越小。本研究中，MDA含量隨低溫脅迫總體呈上升的趨勢，表明膜脂過氧化程度加劇，LT50較高的的大五星丙二醛含量變幅最大，而LT50較低的WT丙二醛變幅最小，說明WT在低溫脅迫中過氧化程度弱，表現(xiàn)出較高清除ROS的能力和較強的抗寒能力。

脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白是植物內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[22-23]，是植物抗寒性鑒定的重要生理指標[24]。本研究結(jié)果顯示，6個枇杷材料的脯氨酸含量隨低溫脅迫均呈現(xiàn)出先升高后降低的倒“V”型變化趨勢，LT50較低的WT脯氨酸含量在低溫脅迫過程中始終處于較高水平且增幅較大，說明低溫脅迫中脯氨酸積累越多，植物的抗寒能力越強，當?shù)蜏丶觿≈率蛊涿赶到y(tǒng)損壞時，種胚中脯氨酸能力降低，脯氨酸含量下降。隨著低溫脅迫的加劇，6個枇杷材料種胚中可溶性糖及可溶性蛋白含量則呈現(xiàn)逐漸增加并趨于平穩(wěn)的態(tài)勢，這與針對柑橘[25]、葡萄[26]、火龍果[27]、草莓[28]等果樹的研究結(jié)果一致。在整個脅迫過程中3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變幅均較為明顯，表明枇杷種胚中脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白對低溫較為敏感，對枇杷抵御低溫逆境具有重要的調(diào)節(jié)作用。

植物的抗寒性受生理生化特征遺傳表現(xiàn)的綜合作用，因此，單一抗寒指標難于判斷植物對低溫的綜合適應(yīng)能力[22]，本研究采用隸屬函數(shù)法對6個枇杷的5項生理指標進行抗寒性綜合評價，表明6個枇杷品種的抗寒能力大小依次為WT>冠玉>寧海白>龍泉5號>早鐘6號>大五星。該結(jié)果與單獨運用半致死溫度LT50評價枇杷的抗寒結(jié)果一致，表明半致死溫度LT50結(jié)合隸屬函數(shù)法的綜合評價能較為準確鑒定枇杷品種的抗寒性。

4? 結(jié)論

低溫脅迫下，6個枇杷品種的生理響應(yīng)存在顯著的差異性，枇杷品種幼果種胚相對電導率REC呈現(xiàn)“小大小”的“S”型曲線變化;Pro含量、MDA含量隨低溫脅迫均呈現(xiàn)出先升高后降低的倒“V”型變化趨勢;可溶性糖和可溶性蛋白含量呈逐漸增加的趨勢。WT對低溫的脅迫具有較強的適應(yīng)性，抗寒能力強，半致死溫度LT50結(jié)合隸屬函數(shù)法的綜合評價能準確鑒定枇杷品種的抗寒性，為枇杷抗寒種質(zhì)的篩選及尋找提高抗寒性的新途徑提供理論依據(jù)。

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