青錢柳葉片中活性成分含量的年動(dòng)態(tài)變化

柏明娥，王麗玲，王衍彬，劉本同，徐高福，秦玉川

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青錢柳葉片中活性成分含量的年動(dòng)態(tài)變化

柏明娥1，王麗玲1，王衍彬1，劉本同1，徐高福2，秦玉川1

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2.浙江省淳安縣新安江開發(fā)總公司，浙江 淳安 311700）

以人工栽培的5年生青錢柳為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)4－9月不同月份采集的青錢柳葉片中黃酮、多糖、三萜及黃酮類化合物的含量測(cè)定，分析葉片中主要活性成分的累積變化規(guī)律。結(jié)果表明：青錢柳葉片中黃酮含量最高為5月份達(dá)4.28%，最低的為6月份為3.16%，5月份的黃酮含量與6，7月間存在極顯著差異（<0.01），與4，8月間存在顯著差異（<0.05），而與9月間無(wú)顯著差異；青錢柳葉片中多糖含量以嫩葉期的4月份為最高，且與其它月份間存在極顯著差異（<0.01），隨著季節(jié)變化總體表現(xiàn)出先下降再緩慢上升的變化規(guī)律；青錢柳葉片中的總皂甙含量4－9月一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，至9月含量最高達(dá)16.47%；葉片中的黃酮類化合物異槲皮甙含量遠(yuǎn)高于槲皮素和山奈酚含量，6個(gè)采樣期的平均值占總黃酮平均值的14.23%，且與總黃酮表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。從青錢柳葉片中主要活性成分的動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，以黃酮和多糖含量為指標(biāo)的采收季節(jié)應(yīng)以4，5月為佳，而以皂甙含量為指標(biāo)的采收季節(jié)應(yīng)以9月為佳。

青錢柳；葉片；活性成分；動(dòng)態(tài)變化

青錢柳系胡桃科Juglandaceae青錢柳屬高大喬木，是冰川世紀(jì)幸存下來(lái)的珍貴樹種，為我國(guó)特有，廣泛分布于江西、浙江、安徽、福建、湖北、四川、貴州、湖南、廣西等地[1]。民間用青錢柳葉制茶飲具有悠久的歷史，其湯澤金黃、味甜，故被稱為“甜茶”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明青錢柳葉中含有多糖、黃酮、三萜皂甙、香豆精、生物堿、有機(jī)酸等天然藥用成分和人體必需的微量元素等[3-6]，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用[7-11]，特別是在糖尿病防治方面功效顯著，被醫(yī)學(xué)界稱之為“天然胰島素”[12]。國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2013年第4號(hào)公告已正式將青錢柳葉列入新食品原料。

青錢柳作為一種具有廣闊發(fā)展前景的樹種已引起了極大的關(guān)注，對(duì)它的研究也在不斷深入。為解決青錢柳天然資源的不足，不少地方進(jìn)行規(guī)?；斯ぴ耘?。因此開展青錢柳葉片中活性成分含量的動(dòng)態(tài)變化研究對(duì)指導(dǎo)青錢柳的資源培育和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不同產(chǎn)地青錢柳中主要活性成分的含量測(cè)定及其累積變化規(guī)律[13-15]，但研究較多的是以自然分布的天然資源。然而，以人工栽培的青錢柳資源為研究對(duì)象且同時(shí)進(jìn)行多糖、黃酮及三萜類成分的含量變化的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以人工栽培的5年生青錢柳為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)不同月份采集的葉片中黃酮、多糖、三萜及黃酮類化合物的含量測(cè)定，分析葉片中主要活性成分的累積變化規(guī)律，為青錢柳資源的定向培育及進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

試驗(yàn)地青錢柳人工栽培基地位于浙江省衢州市上方鎮(zhèn)上龍村，28°20′49″ N，119°04′53″ E，海拔417 m。2014年2月采購(gòu)2年生青錢柳實(shí)生苗進(jìn)行移栽，種苗來(lái)自江西修水，種植時(shí)采用截干法，截干高度為0.5 ~ 0.8 m，種植密度為株間距2 m，行間距4 m，種植面積13.33 hm2。于2017年選取生長(zhǎng)相對(duì)較為一致的3株青錢柳苗作為固定取樣植株，分別于4月26日、5月26日、6月26日、7月26日、8月26日、9月26日在不同方位采集枝條中上部新鮮葉片，去除葉柄，每株約500 g，自然風(fēng)干，50℃干燥至恒重，粉碎后置于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要化學(xué)試劑：蘆?。兌取?8%）、人參皂苷Rb1、槲皮素（純度≥98.5%）、異槲皮苷（純度98%）和山柰酚等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）均購(gòu)自上海晶純生物科技股份有限公司；甲醇、乙醇、濃硫酸、苯酚、三氯化鋁、香草醛、冰醋酸、葡萄糖、高氯酸、磷酸等分析用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州匯普化工儀器有限公司；液相色譜分析用甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純，購(gòu)自天津市康科德科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：UV-759S紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HH-ZK1數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），U3000戴安高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），色譜柱SymmetryC18（美國(guó)Waters公司，5 μm，150x4.6 mm），CleanertC18小柱（杭州邁獅科技有限公司）；CS-700高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取與含量測(cè)定 稱取約1.5 g青錢柳葉烘干樣品，置于250 mL平底燒瓶中，加入50 mL 70%乙醇溶液，80℃水浴回流2 h，過(guò)濾，收集濾液，殘?jiān)儆?0 mL70%乙醇溶液回流提取1 h，過(guò)濾，合并濾液，置100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，作為樣品提取液；黃酮含量的測(cè)定參照李富民等[16]方法。

1.2.2 多糖提取與含量測(cè)定 精密稱取1 g青錢柳葉樣品，置于250 mL平底燒瓶中，加80%乙醇80 mL，90℃回流提取1 h，趁熱抽濾，棄去濾液，濾渣用80%乙醇20 mL洗滌3次，棄去洗液。濾渣連同濾紙一起放入燒瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水80 mL，90℃回流1 h過(guò)濾，重復(fù)加水80 mL，90℃回流1 h過(guò)濾，濾渣用熱水20 m L洗滌2次，合并濾液與洗液，冷卻后定容至250 mL容量瓶作為樣品提取液；多糖含量的測(cè)定參照謝建華等[17]方法，以葡萄糖為對(duì)照品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中以葡萄糖計(jì)的多糖含量。

1.2.3 總皂甙提取與含量測(cè)定 精密稱取青錢柳干燥粉末4 g，加甲醇40 mL，回流提取1 h，趁熱過(guò)濾，收集濾液，殘?jiān)偌蛹状?0 mL，回流提取1 h，趁熱過(guò)濾，合并濾液，冷卻后用甲醇定容至100 mL；實(shí)驗(yàn)以人參皂甙Rbl為對(duì)照品，采用陳金華等[18]方法進(jìn)行總皂苷含量測(cè)定。

1.2.4 黃酮化合物槲皮素、異槲皮甙、山奈酚的測(cè)定 樣品溶液的制備：精密稱取3 g青錢柳葉樣品，加70%甲醇100 mL，回流提取2 h，冷卻后過(guò)濾，用70%甲醇定容至刻度，溶液過(guò)C18小柱備用。

對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱取異槲皮甙標(biāo)準(zhǔn)品用70%甲醇配制成濃度為0.041 6，0.083 2，0.124 8，0.166 4，0.208 0 mg·mL-1的溶液作為異槲皮甙對(duì)照品，精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為0.040 8，0.081 6，0.122 4，0.163 2，0.204 0 mg·mL-1的溶液作為槲皮素對(duì)照品，精密稱取山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為0.036 8，0.073 6，0.110 4，0.147 2，0.184 0 mg·mL-1的溶液作為山柰酚對(duì)照品。

色譜條件：流動(dòng)相選用0.4%磷酸水溶液-甲醇（55:45），等度洗脫，流速1·mL·s-1，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量5 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別精密吸取異槲皮甙、槲皮素、山奈酚不同濃度的對(duì)照品溶液5 μL注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，分別以各自的峰面積為橫坐標(biāo)，濃度（mg·mL-1）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

異槲皮甙線性回歸方程為：=0.005 49（R2=0.999 9）

槲皮素線性回歸方程為：=0.003 29（R2=1）

山柰酚線性回歸方程為：=0.003 04（R2=0.999 9）

在各試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均為良好。樣品測(cè)定與含量計(jì)算：分別吸樣上述樣品溶液5 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品中各成分的含量取3株的平均值，所有數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行繪圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳葉片中黃酮含量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

2017年4－9月，采集的青錢柳葉片中的黃酮含量的變化幅度為3.86% ~ 4.08%，其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律見圖1。由圖1可知，黃酮含量最高的為5月（4.28%），最低的為6月（3.16%），即從4－5月呈上升趨勢(shì)，此時(shí)屬于氣溫適宜的春季，青錢柳處于抽稍長(zhǎng)葉的生長(zhǎng)期；而從5月開始黃酮含量出現(xiàn)下降，至6月份降至最低，可能與此時(shí)在浙江省處于雨水較多的梅雨季節(jié)有關(guān)；從6月以后又呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，至9月升至4.08%，接近于5月時(shí)的含量。方差分析結(jié)果表明5月份的黃酮含量與6，7月間存在極顯著差異（<0.01），與4，8月間存在顯著差異（<0.05），而與9月間無(wú)顯著差異。

注：誤差線上標(biāo)有不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）；標(biāo)有不同大寫字母表示處理間差異極顯著（P<0.01）。下同。

Figure 1 Dynamics of flavonoid content in C.leaves

2.2 青錢柳葉片中多糖含量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

青錢柳葉片中多糖含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律見圖2。由圖2可知，多糖含量最高的為4月份，為2.01%，最低的為7月份，為1.13%；4－9月呈現(xiàn)出“先大幅下降再小幅上升”的變化趨勢(shì)，即從4月開始多糖含量出現(xiàn)下降，至7月降至最低，然后又開始緩慢上升。方差分析結(jié)果表明4月份的多糖含量與其它月份間均存在極顯著差異（<0.01）。

2.3 青錢柳葉片中總皂甙含量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

青錢柳葉片中的總皂甙含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律見圖3。從圖3可以看出，青錢柳葉片中的總皂甙含量4－9月一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4月份含量較低為6.24%，然后逐漸上升，至9月份上升至16.47%，是4月份的2.64倍。青錢柳從4月份新葉長(zhǎng)出，到9月份逐漸成熟變老，說(shuō)明青錢柳葉片中總皂甙的含量隨著葉齡的增大、葉片的成熟而逐漸增大，而且變化幅度明顯大于黃酮和多糖含量的變化幅度。方差分析結(jié)果表明，4月份的皂甙含量與5月份的差異不明顯，與6月份存在顯著差異（<0.05），而與7月、8月、9月間存在極顯著差異（<0.01）。

圖2 青錢柳葉片總皂甙含量的動(dòng)態(tài)變化

Figure 2 Dynamics of total saponins content inleaves

圖3 青錢柳葉片多糖含量的動(dòng)態(tài)變化

Figure 2 Dynamics of polysaccharide content inC.

2.4 青錢柳葉片中黃酮類化合物異槲皮甙、槲皮素、山奈酚含量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

青錢柳葉片樣品的高效液相色譜見圖4，不同月份青錢柳葉片中黃酮類化合物異槲皮甙、槲皮素、山奈酚含量的變化規(guī)律見圖5，圖6。從測(cè)定結(jié)果可以看出，青錢柳片中的黃酮類化合物異槲皮甙的含量相對(duì)較高，而槲皮素、山奈酚的含量相對(duì)較少。

圖4 青錢柳葉片樣品高效液相色譜圖

Figure 4 High performance liquid chromatogram ofleaves

青錢柳葉片中的異槲皮甙含量最高的為9月份達(dá)7.97 mg·g-1，最低的為6月的3.44 mg·g-1，其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律為“先上升后下降再上升”，與總黃酮的變化規(guī)律相似，即4－5月呈上升趨勢(shì)，而5－6月出現(xiàn)一個(gè)下降過(guò)程，從6月份開始又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與總黃酮變化規(guī)律的不同之處在于6月以后的上升幅度較大，至9月升至全年最高。方差分析結(jié)果表明，4月份的異槲皮甙含量與5月、6月間無(wú)顯著差異，與7月有顯著差異（<0.05），而與8月、9月間有極顯著差異（<0.01）。

青錢柳葉片中的槲皮素和山奈酚含量最高的為5月，分別為0.066 1 mg·g-1和0.050 2 mg·g-1，槲皮素含量最低的為6月，而山奈酚含量最低的為8月。從動(dòng)態(tài)變化規(guī)律來(lái)看，槲皮素含量呈現(xiàn)“升-降-升-降-升”的交替變化，而山奈酚含量呈現(xiàn)“先上升后下降”的變化趨勢(shì)，特別是從7月份開始下降幅度較為明顯。方差分析結(jié)果表明4月的槲皮素含量與5月間存在極顯著差異（<0.01），與7月、9月間有顯著差異（<0.05），而與6月、8月間差異不明顯。山奈酚含量4月與5月間有顯著差異（<0.05），與6月、7月間無(wú)顯著差異，而與8月、9月間存在極顯著差異（<0.01）。

圖5 青錢柳葉片異槲皮甙含量動(dòng)態(tài)變化

Figure 5 Dynamics of isoquercirtrin content ins leaves

3 結(jié)論與討論

目前青錢柳的開發(fā)利用主要以茶用為主，收獲的主要是葉片，因此了解青錢柳葉片內(nèi)主要活性成分的含量變化，對(duì)合理確定采收季節(jié)和以提高葉片內(nèi)活性成分含量為目標(biāo)的科學(xué)管理及針對(duì)不同功效成分的產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。通過(guò)上述試驗(yàn)分析表明青錢柳葉片內(nèi)含有豐富的黃酮類化合物、多糖化合物和三萜皂苷類化合物，且這些化合物隨著季節(jié)和葉齡的變化表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。

黃酮及黃酮醇類化合物具有較多的酚羥基團(tuán)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除自由基活性。青錢柳中已報(bào)導(dǎo)至少含有16種黃酮及其苷類成分，主要為黃酮醇類結(jié)構(gòu)，多為葡萄糖或葡萄糖酸苷[2]。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果也表明青錢柳葉片中的黃酮化合物主要以異槲皮甙為主，從其總黃酮及黃酮類化合物的含量變化來(lái)看，黃酮含量最高的為5月份，最低的為6月份，5月份的黃酮含量與6月、7月間存在極顯著差異（<0.01），與8月間存在顯著差異（<0.05），而與4月、9月間無(wú)顯著差異。因此以黃酮含量為指標(biāo)的采收季節(jié)以4月、5月為佳，其次為9月。青錢柳葉片中的黃酮類化合物異槲皮甙、槲皮素、山奈酚在不同采樣期的變化幅度明顯大于總黃酮，測(cè)定結(jié)果表明青錢柳葉片中的黃酮化合物異槲皮甙含量較高，6個(gè)采樣期的平均值占總黃酮平均值的14.23%，而槲皮素、山奈酚含量相對(duì)較少，分別僅占總黃酮平均值的0.08%和0.07%，且異槲皮甙含量隨季節(jié)的變化表現(xiàn)出與總黃酮相似的變化規(guī)律，說(shuō)明異槲皮甙是青錢柳葉片中占主導(dǎo)作用的黃酮類化合物。另外從樣品的高效液相色譜圖可以看出，在近異槲皮甙位置尚有2個(gè)峰較為明顯，具體為何種化合物有待進(jìn)一步研究。

圖6 青錢柳葉槲皮素、山奈酚含量動(dòng)態(tài)變化

Figure 6 Dynamics of quercetin and kaempferol content inleaves

多糖類化合物廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，是由醛基和酮基通過(guò)苷鍵連接的高分子聚合物，也是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，具有多種多樣的生物學(xué)功能[19]。青錢柳中含有較高的多糖含量，并具有多種藥理活性，是近年來(lái)較受關(guān)注的一類成分。從青錢柳多糖的變化規(guī)律來(lái)看，以嫩葉期的4月份含量最高，且與其它月份間均存在極顯著差異（<0.01）。青錢柳為落葉樹種，4月份新葉剛剛長(zhǎng)出，經(jīng)過(guò)一個(gè)冬季的休眠，青錢柳葉片內(nèi)積累了較多的多糖成分，隨著氣溫的逐漸上升，葉片內(nèi)的多糖含量逐漸降低，至7月底降至最低，此時(shí)也是溫度最高的盛夏，隨著秋節(jié)的到來(lái)，氣溫逐漸回落，多糖含量又稍有回升。因此，從多糖成分的變化來(lái)看嫩葉期的4月為最佳采收季節(jié)。

青錢柳中的萜類成分主要有三萜酸及三萜皂苷類，三萜類化合物具有抗腫瘤、抗衰老等諸多作用，青錢柳苷也是青錢柳中特有的天然甜味劑[20-21]。從青錢柳總皂甙含量的變化規(guī)律來(lái)看，表現(xiàn)出與黃酮和多糖不同的變化趨勢(shì)，即隨著葉片的不斷成熟，其含量逐漸增大，且變化幅度較大，說(shuō)明隨著葉齡的增大青錢柳葉片中的總皂甙含量的積累越多。

植物中次生代謝產(chǎn)物的含量差異與不同時(shí)期植物所處的環(huán)境條件如光照、濕度、溫度等因素密切相關(guān)，本試驗(yàn)僅對(duì)青錢柳葉片中主要的幾類化合物的含量變化進(jìn)行研究，至于引起這些變化的原因有待進(jìn)一步研究。

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Dynamic Change of Active Components in Leaves of

BAI Ming-e1，WANG Li-ling1，WANG Yan-bin1，LIU Ben-tong1，XU Gao-fu2，QIN Yu-chuan1

（1.Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2.Chun’an Xin’anjiang Development Corporation of Zhejiang, Chun’an 311700, China）

Collection of 5-yearleaves were conducted from April to September of 2017 at cultivation base of artificialforest in Quzhou of Zhejiang province.Determination and analysis was made on total flavonoids, polysaccharides, triterpenoids andflavonoid compounds in leaves.The results showed that the highest content of total flavonoids was 4.28% in May, and the lowest was 3.16% in June.There was extremely significant differences of flavonoid content in May with that in June and July, significant differences with that in April and August.The content of polysaccharides in leaves was the highest in April, and there was significant difference with in the other months.Total saponins content had trend of increase in leaves from April to September, 16.47%, the highest in September.The content of isoquercetin was much higher than that of quercetin and kaempferol in leaves, the mean of 6 months samples occupied 14.23% of total flavonoids and showed a similar dynamic change of total flavonoids.According to the dynamic changes of main active constituents, the best period for leaf collection was in April and May for much content of flavonoids and polysaccharides, while in September for saponins.

; leaf; active constituents; dynamic change

S792.99

A

1001-3776（2018）05-0021-06

2018-06-04；

2018-08-22

浙江省省屬科研院所扶持專項(xiàng)“葉用青錢柳定向培育技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)”（2017F30019）

柏明娥，研究員，從事資源植物開發(fā)；E-mail：baiminge66@163.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.004