葛根芩連湯干預(yù)DSS模型小鼠血清炎癥因子的實(shí)驗(yàn)研究※

高 威，李 杰，任延明，劉 杰，曹成珠，紀(jì)巧榮，寇 娜，張 偉*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)，青海 西寧 810000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的在大腸粘膜發(fā)生的慢性炎癥和潰瘍性病變[1]。病情輕重不等，且具有潛在的癌變可能性[2]。目前臨床上主要應(yīng)用柳氮磺胺吡啶、水楊酸制劑對(duì)UC進(jìn)行治療。本研究應(yīng)用中藥治療模型小鼠UC，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康未孕SPF級(jí)、雌性BALb/c小鼠48只，體重(22±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXX(京)2012-0001，合格證號(hào)：11400700176022。

每組7只分開飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分組，在第一部分實(shí)驗(yàn)中將小鼠分為四組：正常組、中藥組和DSS組、中藥+DSS組，實(shí)驗(yàn)周期7 d。正常組予潔凈水自由飲用7 d的同時(shí)連續(xù)灌胃(0.9%NS，0.15mL·10g/d)；DSS組予3.5% DSS自由飲用7 d的同時(shí)連續(xù)灌胃(0.9%NS，劑量同上)；中藥組予潔凈水自由飲用7 d的同時(shí)連續(xù)灌胃(葛根芩連湯，0.15mL/10g·d[3])7 d；中藥+DSS組在給予3.5% DSS自由飲用的同時(shí)連續(xù)灌胃(葛根芩連湯，0.15mL/10g·d)7 d。在第二部分實(shí)驗(yàn)中將小鼠分為四組：正常組、中藥組和UC組、中藥+UC組，實(shí)驗(yàn)周期14 d。正常組予潔凈水自由飲用7 d后連續(xù)灌胃(0.9%NS，0.15mL/10g·d)7 d；UC組予3.5% DSS自由飲用7 d后改為飲用潔凈水(7 d)；中藥組予潔凈水自由飲用7 d后連續(xù)灌胃(葛根芩連湯，0.15mL/10g·d)；中藥+UC組造模成功后(予3.5% DSS自由飲用7d)連續(xù)灌胃(葛根芩連湯，0.15mL/10g·d)7 d。

造模成功與否判定：出現(xiàn)以下表現(xiàn)，表明UC模型造模成功，①造模3～5 d后出現(xiàn)大便溏瀉，肛周有污物，甚至血便；②嗜臥；③毛色枯槁不榮；④食量明顯下降；⑤光鏡下見(jiàn)模型組小鼠結(jié)腸組織潰瘍形成。

1.2 藥物和試劑

DSS購(gòu)自MBIO，商品編號(hào)：160110。葛根芩連湯依據(jù)《傷寒論》中要求的煎煮法制備：取葛根15 g，加入5倍量無(wú)菌蒸餾水，浸過(guò)中藥液面，以文火煮至沸騰，沸騰10 min，再加入黃芩9 g、黃連9 g、甘草(炙)6 g，文火煮至沸騰，沸騰20 min，過(guò)濾后，續(xù)加五倍量蒸餾水，文火煮至沸騰，沸騰30 min后，再次過(guò)濾。將兩次過(guò)濾所得藥液混合，在文火上濃縮至39 mL，即為100%(1g/mL)的中藥原液。ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司，IL-4貨號(hào)：E-EL-M0043c；IFN-γ貨號(hào)：E-EL-M0048c；TNF-α貨號(hào)：E-EL-M0049c。

1.3 儀器

臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)(Sigma 3K15)，酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士(TECAN Infnite 200pro)。

1.4 標(biāo)本

第一、二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)本收集：于心臟采血1 mL，在4 ℃條件下離心(4000r/min)15 min制備血清，低溫保存?zhèn)錅y(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況

正常組和中藥組的小鼠整體表現(xiàn)正常，精神狀態(tài)良好。模型組小鼠在自由飲用DSS 3～5 d后，毛發(fā)失榮，狀態(tài)萎靡，喜臥，身體蜷縮，進(jìn)水進(jìn)食量明顯減少，大便稀溏，有便血。給藥后，中藥+DSS組及中藥+UC組小鼠一般狀況均有改善。

2.2 葛根芩連湯對(duì)小鼠血清IL-4、IFN-γ、TNF-α表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，在造模過(guò)程中給藥，DSS組和其他三組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常組和中藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模成功后給藥，UC組和其他三組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，正常組和中藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1～2)。

組別nIL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)DSS組531.34±4.1728.42±0.9124.31±2.36正常組576.55±7.65※17.62±1.32※15.93±1.99※中藥組577.01±7.42※16.49±0.63※15.52±1.77※中藥+DSS組563.72±4.29※▲#20.59±1.22※▲#19.40±1.45※▲#F 61.587 129.861 22.447P 0.000 0.000 0.000

※：與DSS組比較，P<0.05；▲：與正常組比較，P<0.05；#：與中藥組比較，P<0.05

組別nIL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)UC組543.47±6.3626.26±0.2323.82±3.16正常組575.99±7.10※17.41±1.06※15.92±2.02※中藥組575.30±4.50※16.22±1.33※15.53±1.73※中藥+UC組562.53±2.35※▲#22.14±0.56※▲#19.32±0.77※▲#F 39.708 130.374 16.756P 0.000 0.000 0.000

※：與UC組比較，P<0.05；▲：與正常組比較，P<0.05；#：與中藥組比較，P<0.05

3 討論

UC在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于泄瀉、痢疾等范疇，可歸為中醫(yī)的濕熱病[4]。本研究以DSS誘導(dǎo)的UC小鼠為模型，研究葛根芩連湯對(duì)DSS造模前后小鼠血清IL-4、IFN-γ、TNF-α表達(dá)水平的影響，為臨床診斷及治療提供客觀依據(jù)。

UC的發(fā)病機(jī)制至今不明，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)免疫因素在UC發(fā)病機(jī)制中尤為重要[5]。大量文獻(xiàn)顯示，許多細(xì)胞因子參與結(jié)腸粘膜的炎癥免疫反應(yīng)，與UC的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。眾所周知，細(xì)胞因子可分為促炎因子和抑炎因子兩大類，在正常人群中促炎因子如TNF-α等和抑炎因子如IL-4、IL-10等處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如若失衡，則會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

IL-4主要是由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，能有效抑制炎性反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)，IL-4對(duì)維持腸道免疫功能有重要的作用[6]。近年來(lái)有研究報(bào)道認(rèn)為，UC的炎性反應(yīng)程度與IL-4的表達(dá)有一定的相關(guān)性，可以用來(lái)評(píng)估UC的炎性反應(yīng)程度[7]，IL-4是通過(guò)抑制Th1細(xì)胞的增殖功能來(lái)抑制腸道炎癥的發(fā)生[8]。我們的研究顯示，模型組小鼠血清IL-4蛋白表達(dá)水平顯著降低，而予葛根芩連湯干預(yù)后，又明顯增高，表明了葛根芩連湯具有促進(jìn)IL-4蛋白表達(dá)的作用。

INF-γ主要由Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一種具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴因子，能引起腸道炎癥反應(yīng)[9]。TNF是一個(gè)主要的炎癥介質(zhì)，TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)起重要作用[10]。TNF-α可通過(guò)誘導(dǎo)血栓生成使腸黏膜血液循環(huán)發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜組織廣泛損傷[11]。 當(dāng)與INF-γ協(xié)同作用時(shí)，可以殺傷上皮細(xì)胞，使炎癥加重。且有研究發(fā)現(xiàn)，由Th1產(chǎn)生的INF-γ能夠抑制Th2細(xì)胞的增殖，而由Th2細(xì)胞分泌的IL-4能抑制Th1反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在模型組小鼠血清中，INF-γ和TNF-α的表達(dá)顯著升高，而在使用中藥干預(yù)后，其表達(dá)又明顯降低，表明了葛根芩連湯具有抑制INF-γ、TNF-α表達(dá)的作用。

根據(jù)對(duì)葛根芩連湯的現(xiàn)代研究，方中葛根的有效成分為葛根素，而葛根素具有明顯的抗炎及抗氧化作用；黃芩的有效成分為黃芩苷，黃芩苷亦具有抗氧化、抗炎作用以及抗病原微生物的作用；黃連的有效成分為生物堿類，具有代表性的化合物有小檗堿，小檗堿具有較強(qiáng)的抗病原微生物的作用；甘草的有效成分為多糖類[13]，具有明顯的抗炎及抗病毒作用。余林中等[14]研究了葛根芩連湯各配伍與抗腹瀉藥效之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在降低小腸推進(jìn)率的影響中，以黃連與炙甘草發(fā)揮的作用為主。概而言之，葛根芩連湯具有抗菌、抗病毒、抑制胃腸運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用。

綜上所述，本研究依據(jù)中、西醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，用DSS造模的方法成功建立了UC小鼠模型。在造模過(guò)程中及造模成功后予葛根芩連湯干預(yù)，小鼠血清IL-4、INF-γ和TNF-α表達(dá)結(jié)果顯示葛根芩連湯在造模過(guò)程中能明顯抑制促炎因子INF-γ和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子IL-4的表達(dá)，表明了葛根芩連湯對(duì)小鼠結(jié)腸組織有明顯的保護(hù)作用及治療作用。