低氧下K562細(xì)胞紅系分化模型的構(gòu)建#

胡彩艷，劉 芳，付成冰，丁 謹(jǐn)，張慧潔

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，青海 西寧 810001)

目前，高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。在研究過程中證實(shí)多種蛋白因子和miRNA參與其中，如GATA-1、HIF、miR-451a等[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞造模的方式模擬正常紅系發(fā)育過程已成為廣泛采用的實(shí)驗(yàn)手段。K562、MEL、TF-1細(xì)胞等已成為國(guó)際通用的造模細(xì)胞，這其中人類白血病K562細(xì)胞被廣泛用作適合于紅細(xì)胞生成研究的模型細(xì)胞系[2]。文獻(xiàn)顯示，K562細(xì)胞行為上更像是未分化的早期多潛能造血祖細(xì)胞[3]。其可被多種不同的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)向不同細(xì)胞系分化[3-4]，其中K562細(xì)胞可以被分化誘導(dǎo)劑(如氯高鐵血紅素等)誘導(dǎo)向紅系分化，出現(xiàn)紅系分化成熟的標(biāo)志物，如胎兒血紅蛋白、唾液酸糖蛋白、乙酰膽堿酯酶等。在低氧下利用K562細(xì)胞建立紅系分化模型時(shí)采用的氧濃度條件存在差異，有的實(shí)驗(yàn)人員采用1%氧濃度為條件[5]，也有采用3%氧的情況[6]。

基于此，我們?cè)诓煌鯘舛认路謩e建立紅系分化模型，并選擇出更為合適的氧濃度作為建模條件，以該模型為基礎(chǔ)探討低氧環(huán)境對(duì)紅系分化過程中相關(guān)miRNA功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

K562細(xì)胞購(gòu)于中喬新舟公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自四季青公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，qRT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司，CD235a流式抗體購(gòu)自Biolegend公司，MTS溶液購(gòu)自Promega公司，PI染液購(gòu)自BD公司。

Binder三氣培養(yǎng)箱、Eppendorf PCR擴(kuò)增儀、ABI7500熒光定量PCR儀、Beckman流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 分組

按細(xì)胞培養(yǎng)條件分為3組，常氧組(37℃，5%CO2，21%O2，飽和濕度)、1%低氧組(37℃，5%CO2，飽和濕度、N2)及3%低氧組(37℃，5%CO2，飽和濕度、N2)。以上三組細(xì)胞分別加入hemin誘導(dǎo)0、48、72、96 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)胞陽(yáng)性率檢測(cè)

用聯(lián)苯胺染色檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性率：收集造模完成的三組細(xì)胞，加入聯(lián)苯胺溶液15 μL、3%H2O210 μL，3 min后加入1 μL硝普鈉溶液；10 min后觀察染色結(jié)果。

(2)γ-globin表達(dá)水平檢測(cè)

用qRT-PCR法檢測(cè)γ-globin表達(dá)水平：分離提取total RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測(cè)細(xì)胞中γ-globin的表達(dá)水平。引物序列見表1。

(3)表面標(biāo)記CD235a 的表達(dá)變化檢測(cè)

表1引物序列

Table 1Primer sequences

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記CD235a 的表達(dá)變化：收集細(xì)胞樣品用PBS洗兩遍后，用PBS重懸至細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，從中取出100 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到流式管中，加入CD235a抗體5 μL，混勻后避光孵育15 min；加入1 mL PBS清洗去多余抗體，離心后加入500 μL PBS重懸，過篩后上機(jī)檢測(cè)。

(4)細(xì)胞增殖水平檢測(cè)

用MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平：存放上述三組細(xì)胞的孔中加入20 μL MTS溶液，混勻后置于37 ℃孵育1～2 h，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值。

(5)細(xì)胞周期檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況：采用血清饑餓法將K562細(xì)胞做同步化處理，取同步化后的細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理。在收集的細(xì)胞沉淀中逐滴加入70%～80%的乙醇固定，過夜(4℃)后；清洗兩遍，加入500 μL PI染液混勻，室溫避光孵育15 min，過篩后上機(jī)檢測(cè)。

(6)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平：收集樣品用PBS清洗兩遍后，用PBS重懸，分別加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混勻后孵育(室溫，避光)15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果分析

2.1 對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增長(zhǎng)速率確定指數(shù)增長(zhǎng)期

查閱文獻(xiàn)得知，在建立細(xì)胞模型時(shí)，通常選用指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行給藥處理能夠獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，我們每隔24 h對(duì)傳代的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線確定指數(shù)增長(zhǎng)期。如圖1所示，48～72 h細(xì)胞增殖速度最快，為指數(shù)增長(zhǎng)期，所以我們選擇在此時(shí)間段內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理。

圖1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Figure1Growthcurveofthecells

2.2 對(duì)比不同hemin濃度下的分化程度

為確定合適的hemin濃度，我們分別采用30、40 μM的劑量進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為48、72、96 h。結(jié)果如圖2、表2所示，依據(jù)結(jié)果，我們選擇40 μM的劑量進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。

圖2聯(lián)苯胺染色結(jié)果(100×)

Figure2Resultsofbenzidinestaining(100 ×)

Table 2The positive cell rate of Benzidine staining induced by different concentrations of

*：組間比較，P<0.05

2.3 對(duì)比不同氧濃度下的分化效率

(1)聯(lián)苯胺染色檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞率

如圖3、4和表3、4所示，不同氧濃度下聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞率表明，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間，陽(yáng)性細(xì)胞率均呈上升趨勢(shì)(P<0.05)；對(duì)比常氧與低氧組可以看出，低氧組的陽(yáng)性細(xì)胞率高于常氧組(P<0.05)，并且1%氧濃度下，常氧、低氧間陽(yáng)性率的差異更為明顯。

圖3 1%O2聯(lián)苯胺染色結(jié)果(100×)

Figure3Theresultsof1%O2Benzidinestaining(100 ×)

組別n24h(%)48h(%)72h(%)96h(%)FP常氧組320.92±2.3134.15±5.87#58.23±0.88#66.97±2.49#115.9150.0001%低氧組318.56±2.3749.32±7.23?#64.86±0.47?#74.41±1.53?#118.6290.000t 2.607 -2.789 -11.511 -4.045P 0.060 0.049 0.000 0.016

#：組內(nèi)24h比較，P<0.05；*：同一時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，P<0.05

圖4 3%O2聯(lián)苯胺染色結(jié)果(100×)

組別n24h(%)48h(%)72h(%)96h(%)FP常氧組319.78±0.5437.43±0.53#50.91±1.85#57.85±0.45#804.4730.0003%低氧組321.27±0.7840.89±4.05#54.85±0.95#59.76±1.96#164.0590.000t -2.720 -1.330 -3.281 -1.645P 0.053 0.254 0.03 0.175

#：組內(nèi)24h比較，P<0.05；*：同一時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，P<0.05

(2)qRT-PCR檢測(cè)γ-globin變化

結(jié)果如表5、6所示，隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，γ-globin的表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中在96 h低氧組表達(dá)水平明顯高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同氧濃度條件下，我們發(fā)現(xiàn)尤其在96 h時(shí)，1%氧條件下γ-globin表達(dá)水平是常氧組的2.5倍，而3%氧條件下γ-globin的表達(dá)水平是常氧組的1.4倍。

Table 5The detection of γ-globin by qRT-PCR at 1% oxygen

#：組內(nèi)0h比較，P<0.05；*：同一時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，P<0.05

Table 6The detection of γ-globin by qRT-PCR at 3% oxygen

#：組內(nèi)0h比較，P<0.05；*：同一時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，P<0.05

(3)流式檢測(cè)CD235a的表達(dá)變化情況

結(jié)果如圖5、表7所示，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，從不同氧濃度條件下CD235a陽(yáng)性細(xì)胞的比例變化看出，在1%氧的條件下低氧96 h顯著高于常氧(P<0.05)，且陽(yáng)性細(xì)胞率高于3%低氧條件；在3%氧條件下CD235a的比例隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，呈逐步下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5不同氧濃度下CD235a陽(yáng)性細(xì)胞率流式結(jié)果圖

Figure5FlowcytometryresultsofCD235apositiveratioofcellsatdifferentoxygenconcentrations

Table 7Changes of CD235a positive cell rate at different oxygen

#：組內(nèi)0h比較，P<0.05；*：同一時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，P<0.05

2.4 對(duì)比不同氧濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響

(1)MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平變化

MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示，常氧和低氧狀態(tài)下細(xì)胞增殖率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)1%氧濃度和3%氧濃度下細(xì)胞增殖率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Table 8MTS proliferation at different oxygen

(2)流式檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果如圖6、表9所示，K562細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h后，約有53%的細(xì)胞阻斷在G0/G1期，常規(guī)培養(yǎng)并經(jīng)hemin誘導(dǎo)后，做不同氧濃度與常氧對(duì)比發(fā)現(xiàn)，S期與G2/M期的細(xì)胞所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表示無(wú)論1%還是3%O2條件下，處于增殖期的細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。

圖6不同氧濃度下細(xì)胞周期流式結(jié)果圖

Figure6Flowcytometryresultsofcellcycleatdifferentoxygenconcentrations

Table 9Cell cycle results at different oxygen

2.5 對(duì)比不同氧濃度對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

用AnnexinV-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。為檢測(cè)不同氧濃度下，由hemin誘導(dǎo)后的細(xì)胞的凋亡水平經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)上升趨勢(shì)；但不同氧濃度條件下的細(xì)胞凋亡率均與常氧情況無(wú)明顯差異，結(jié)果如圖7、表10所示。

圖7不同氧濃度下細(xì)胞凋亡流式結(jié)果圖

Figure7Flowcytometryresultsofcellapoptosisatdifferentoxygenconcentrations

Table 10Cell apoptosis rate at different oxygen

3 討論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HAPC發(fā)病機(jī)制從分化、增殖和凋亡三方面進(jìn)行深入探討。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下促紅細(xì)胞生成素(EPO)等紅系分化相關(guān)因子表達(dá)被促進(jìn)，通過與骨髓中的相應(yīng)受體結(jié)合來(lái)促進(jìn)造血干祖細(xì)胞向紅系分化[7-8]。也有學(xué)者證實(shí)，慢性缺氧可通過上調(diào)各種核轉(zhuǎn)錄因子如血管內(nèi)皮因子(VEGF)等介導(dǎo)紅細(xì)胞的增殖[9-10]。

紅細(xì)胞生成是紅細(xì)胞生成過程的一個(gè)多步驟過程，由內(nèi)在自身因素和外在環(huán)境因素共同控制[11]。機(jī)體中的氧含量是影響紅細(xì)胞生成的重要因素之一[12]。骨髓微環(huán)境中的氧水平控制著紅細(xì)胞祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用；并且，氧含量的變化也能夠影響珠蛋白基因的表達(dá)[13-14]。

人類紅細(xì)胞樣細(xì)胞系、K562細(xì)胞系，來(lái)自于白血病患者的細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)過程中成長(zhǎng)為單一的、未分化的細(xì)胞，并且其自身血紅蛋白表達(dá)水平低。因此，其被一些學(xué)者作為模型應(yīng)用于分子水平檢測(cè)紅系分化水平。當(dāng)受到某些藥物刺激時(shí)，如氯化血紅素，其能夠在幾天內(nèi)作出反應(yīng)(在血紅蛋白的產(chǎn)生和其他一些紅細(xì)胞特殊標(biāo)記物的表達(dá)上有明顯的增加)[15]。

在應(yīng)用K562細(xì)胞系建立低氧下紅系分化模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)小組對(duì)于hemin濃度和氧濃度的選擇存在差異。根據(jù)細(xì)胞的不同時(shí)間生長(zhǎng)特性，我們選擇在其細(xì)胞活性最佳時(shí)期對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)。作為誘導(dǎo)劑的hemin本身對(duì)細(xì)胞存在毒性，并且濃度越高毒性越大，影響細(xì)胞正?；顒?dòng)。因此，為確保后期實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，對(duì)于誘導(dǎo)劑濃度的選擇尤其重要。以往文獻(xiàn)報(bào)道，常用hemin濃度為30或40 μM[16-19]，我們分別采用兩種濃度誘導(dǎo)細(xì)胞分化，以聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)誘導(dǎo)效率，最終確定hemin濃度為40 μM。氧濃度則是我們建立低氧下紅系分化模型至關(guān)重要的條件，合適的氧濃度不僅能夠使相關(guān)基因的表達(dá)水平與常氧條件下呈現(xiàn)明顯差異，同時(shí)最大程度避免對(duì)細(xì)胞正常生命活動(dòng)的影響，也為后期檢測(cè)不同蛋白因子及小RNA的變化奠定基礎(chǔ)。為探究更為合適的氧濃度，我們?cè)诓煌鯘舛认陆⒘思?xì)胞模型，采用聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性率、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)γ-globin、流式法檢測(cè)紅系特異表面標(biāo)記CD235a來(lái)確定模型建立是否成功，并確定分化效果更為理想的建模條件。

本研究結(jié)果顯示，在分化水平上，從聯(lián)苯胺染色結(jié)果來(lái)看，1%氧條件下，72、96 h常氧低氧差異更為明顯；從CD235a的流式檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，CD235a通常在紅系分化過程的中晚期開始表達(dá)，晚期呈高表達(dá)，由于K562細(xì)胞自身CD235a的表達(dá)水平較高，所以在K562紅系分化模型中先出現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程延伸，出現(xiàn)上升趨勢(shì)。3%氧條件下，在0～96 h間持續(xù)下降，低氧表達(dá)水平高于常氧；而在1%氧條件下，則出現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，由此可見1%氧條件下加速了紅系分化的進(jìn)程；從γ-globin 的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，1%氧條件下，96 h低氧組的表達(dá)水平是常氧的2.5倍；但3%氧條件下，這一倍數(shù)僅為1.4，因此，1%氧在促進(jìn)紅系分化的過程中作用更加顯著。無(wú)論氧濃度為1%或3%，細(xì)胞的增殖率并無(wú)明顯差異，說明不同濃度氧對(duì)細(xì)胞增殖的影響無(wú)明顯差異；凋亡率結(jié)果顯示，低氧能夠增加細(xì)胞凋亡率，且1%O2凋亡率略高于3%O2，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此我們認(rèn)為，選擇1%氧濃度作為建立低氧下紅系分化模型的條件更為合適。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確立的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，構(gòu)建了符合試驗(yàn)要求的較為理想的K562紅系分化模型(低氧下)，為后期miRNA的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。