miR-153靶向調(diào)控GALNT7對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

徐啟英，左 英，郭桂蘭，任玉環(huán)，李學(xué)靜

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青海 西寧 810001)

microRNA(miRNA)是一種可以結(jié)合在靶基因mRNA3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的小RNA分子，通過(guò)降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。現(xiàn)有研究表明，很多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展都與miRNA的失調(diào)有關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)miR-153與很多癌癥都密切相關(guān)，如乳腺癌[1]、結(jié)腸直腸癌[2]、食道癌[3]、胰腺癌[4]、胃癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、卵巢癌[7]等。因此它被當(dāng)做癌癥的潛在目標(biāo)基因[8-10]。

已有研究顯示，miR-153在宮頸癌(Cervical cancer)中可能作為一種腫瘤抑制因子，因此研究其對(duì)宮頸癌的抑癌機(jī)制有一定意義。

通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GALNT7可能是miR-153的靶基因。GALNT7是N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族中的成員，是催化O-聚糖合成第一步的酶，O-糖基化與細(xì)胞識(shí)別，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和黏附等功能密切相關(guān)。

本研究探討miR-153(microRNA-153)靶向調(diào)控GALNT7對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑選擇

宮頸癌細(xì)胞系Hela、C-33A購(gòu)于ATCC公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司。miR-153、miR NC購(gòu)于TaKaRa公司。脂質(zhì)體購(gòu)于ThermoFisher公司。GALNT7、GADPH抗體及HRP標(biāo)記二抗購(gòu)于SIGMA-ALDRICH公司。雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)試劑盒購(gòu)于Promega公司。

1.2 miR-153對(duì)GALNT7靶向作用的驗(yàn)證

采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-153對(duì)GALNT7靶向的作用。將Hela、C-33A以2 ×105/孔接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，參照Lipo2000(ThermoFisher公司)的說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染分組：pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-153組、pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-NC組；pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/miR-153組、pMIR-report-3′UTRm/miR-NC組。pRL-TK質(zhì)粒表達(dá)海腎熒光素酶，pMIR-report-3′UTR為表達(dá)螢火蟲熒光素酶的非突變質(zhì)粒載體，pMIR-report-3′UTRm是表達(dá)螢火蟲熒光素酶的突變質(zhì)粒載體。Hela、C-33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用裂解液提取蛋白，利用熒光素酶試劑盒進(jìn)行操作，向孔板中依次加入LARⅡ和stop/glo，前者檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，后者檢測(cè)海腎熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

Hela、C-33A細(xì)胞需要在37 ℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。用胰蛋白酶將兩種細(xì)胞消化后，將其濃度調(diào)整為3×105/mL，取出1 mL接種至6孔板中，恒溫(37℃)培養(yǎng)24 h，將接種的細(xì)胞分為三組：control、miR-NC和miR-153組，參照Lipo3000(ThermoFisher公司)的說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

將Hela、C-33A細(xì)胞分別接種于24孔(3×104/孔)中，培養(yǎng)24 h后，參照Lipo3000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。分為control、miR-NC、miR-153組。Hela、C-33A分別轉(zhuǎn)染48 h后，將收集的細(xì)胞裂解后提取mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后，進(jìn)入熔解段(95℃ 15S，60℃ 30S，95℃ 15s)，反應(yīng)終止。用2-ΔΔCt計(jì)算GALNT7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，裂解的蛋白用BCA定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(恒流35mA、1h)。經(jīng)凝膠電泳分離后，將蛋白半干轉(zhuǎn)至 PVDF膜上(20V，1h)，用含5%脫脂奶粉的TBS進(jìn)行封閉。用一抗(兔抗人GALNT7、兔抗人GAPDH抗體)在室溫下孵育2 h、TBST洗膜(3times×5min)；用二抗(羊抗兔HRP)在室溫下孵育1 h、TBST洗膜(3times×5min)，以ECL顯影。使用軟件測(cè)定條帶灰度值。

1.6 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)

兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)，分別以1×104/孔的濃度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

Hela、C-33A細(xì)胞分別接種于24孔板(3×105/孔)中，培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿24孔板時(shí)，用10 μL移液器槍頭進(jìn)行劃痕，0、24 h時(shí)進(jìn)行拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化Hela、C-33A細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心，用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，將細(xì)胞懸浮液接種至Transwell小室中，分為control、miR-NC、miR-153組，下室中加入600 μL含血清的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用PBS洗5min，棄去PBS，用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用棉簽將小室的上層細(xì)胞擦掉，用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選用Graphpad prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)采用mean±SD，兩組數(shù)據(jù)采用雙樣本t檢驗(yàn)。兩組以上的數(shù)據(jù)采用one way ANOVA 軟件進(jìn)行分析，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-153靶向作用GALNT7的驗(yàn)證

通過(guò)生物學(xué)軟件可以得出，miR-153可能靶向結(jié)合GALNT7的3′-UTR(圖1A)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3′-UTR組中，與miR-NC相比，miR-153組熒光素酶的活力值明顯降低，差異具有意義(P<0.05)。但3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)突變(3′UTRm)之后，熒光素酶的活性無(wú)明顯變化(圖1B)，證明miR-153已靶向結(jié)合GALNT7的3′UTR。

Figure1Therelativeactivityexpressionofluciferase

2.2 miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞GALNT7 mRNA和蛋白的抑制

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在Hela細(xì)胞中，miR-153組GALNT7的mRNA相對(duì)表達(dá)量是0.43，在C-33A細(xì)胞中，miR-153組為0.22(圖2A、B)，可以看出miR-153可下調(diào)GALNT7的mRNA的表達(dá)均低于miR-NC及control組。免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Hela細(xì)胞中，miR-153組GALNT7的蛋白相對(duì)表達(dá)量是0.25，在C-33A細(xì)胞中是0.37(圖2C、D)。均低于miR-NC及control組。由此可知，在宮頸癌細(xì)胞中，miR-153下調(diào) GALNT7 mRNA和蛋白的表達(dá)，對(duì)其mRNA和蛋白的表達(dá)具有明顯抑制作用，差異具有意義(P<0.05)。

Figure2ExpressionofGALNT7mRNAandproteinafterHelaAndC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.3 miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

將Hela和C-33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-153 24、48、72 h時(shí)，用CCK8試劑盒分別檢測(cè)其A450值并繪制生長(zhǎng)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)，在Hela和C-33A細(xì)胞中，與control、miR-NC組相比，miR-153組的A450值明顯下降，說(shuō)明miR-153可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力(圖3A、B )。

Figure3SchematicdiagramofcellproliferationinhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.4 miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響

經(jīng)Transwell小室檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Hela中，miR-153組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為261±9.08，其他兩組的細(xì)胞數(shù)量分別為258±8.78、90±5.12 ，在C-33A中前者的細(xì)胞數(shù)為250±8.03，后兩者分別為249±7.56、84±4.23，可以看出miR-153組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力有明顯抑制作用(圖4A、B)，差異均具有顯著意義(P<0.05)。

Figure4SchematicdiagramofcellinvasioninhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.5 miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞長(zhǎng)滿24孔板時(shí)劃痕，并在0、24 h拍照。結(jié)果顯示，在Hela和C-33A中，24 h與0 h相比，miR-153組細(xì)胞間的距離明顯大于其他兩組(圖5 A、C)，miR-153組細(xì)胞的愈合百分?jǐn)?shù)下降(圖5B、D)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-153后，細(xì)胞愈合劃痕的能力明顯下降，表明miR-153能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)。

Figure5SchematicdiagramofcellmigrationinhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

3 討論

microRNA(miRNA)主要是通過(guò)與靶基因3′-UTR的結(jié)合導(dǎo)致其mRNA的降解或者抑制其基因轉(zhuǎn)錄從而降低靶基因的表達(dá)水平[11-14]。許多文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，miRNA在癌癥的整個(gè)過(guò)程中起著很重要的作用，包括宮頸癌。雖然總體存活率隨著醫(yī)療手段的進(jìn)步有所提高[15]，但結(jié)果仍然不理想。因此闡明宮頸癌的分子機(jī)制對(duì)于宮頸癌患者的治療具有重要意義。

miR-153已被證實(shí)是很多癌癥的關(guān)鍵參與者。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌中，它是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展。在肝癌中，它影響肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。在胃癌中，它與患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在結(jié)腸直腸癌中也與腫瘤細(xì)胞的侵襲有關(guān)。在很多癌癥中，它都是作為致癌因子或者腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[3-10]。miR-153在宮頸癌中的作用部分已被闡明。它通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)抑制宮頸癌的發(fā)展過(guò)程，并且miR-153與患者5年的存活率、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移等都有關(guān)?？傊?，miR-153通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)抑制腫瘤的進(jìn)展，且與很多不良結(jié)果之間有關(guān)聯(lián)。因此，miR-153對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。但尚無(wú)關(guān)于宮頸癌中miR-153靶基因的報(bào)道，因此尋找miR-153的靶基因可以作為宮頸癌的治療策略。

本研究證實(shí)miR-153靶向結(jié)合GALNT7的3′-UTR進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)。結(jié)果顯示miR-153對(duì)GALNT7 mRNA和蛋白的表達(dá)量有顯著抑制作用，這可能是因?yàn)閙iR-153與GALNT7 的mRNA序列互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合導(dǎo)致其對(duì)mRNA降解，進(jìn)而抑制GALNT7的蛋白表達(dá)。在順時(shí)轉(zhuǎn)染miR-153后，用CCK8實(shí)驗(yàn)可以看出，miR-153對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。本研究通過(guò)Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)也證明，miR-153組宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯下降。細(xì)胞的遷移和侵襲能力可能與腫瘤的復(fù)發(fā)、惡化息息相關(guān)。因此，本研究顯示miR-153可能通過(guò)靶向調(diào)控GALNT7進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。最后，我們可以這樣推測(cè)，下調(diào)靶基因GALNT7 mRNA和蛋白的表達(dá)，是miR-153抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制之一。