膽堿能抗炎通路在子癇前期患者母胎界面的表達(dá)及意義

鄭林媚 施蕾 周忠義 陳小菊 王莉 唐榮 盧志誠

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有且常見疾病，是產(chǎn)科中導(dǎo)致母兒發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]，其病因和確切發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。目前普遍認(rèn)為子癇前期是一種母體系統(tǒng)性的過度性炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為母胎界面與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子有關(guān)的炎性細(xì)胞激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂和損傷以及滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移受限、淺著床。Borovikova在2000年首次提出“膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)”[2]，即炎癥刺激信號通過迷走神經(jīng)傳入，經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)將信息整合后，傳出至神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)，作用于炎癥細(xì)胞上的α7 煙堿型乙酰膽堿受體(alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)，抑制促炎細(xì)胞因子釋放。研究證實子癇前期患者較正常妊娠孕婦晚期ACh增加，推測膽堿能抗感染通路可能與子癇前期發(fā)病之間有一定聯(lián)系[3]。但該通路在子癇前期中是否發(fā)揮作用以及如何作用，目前尚不清楚。本試驗旨在通過測定正常妊娠孕婦和子癇前期患者胎盤組織中α7nAChR及核因子-κB(nuclear factor-kB，NF-κB)的表達(dá)水平及相關(guān)炎癥因子的變化及其意義，探討膽堿能抗炎通路與子癇前期的關(guān)系，為研究子癇前期發(fā)病機(jī)制及防治策略提供新的概念和理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年1月～2016年1月海南省人民醫(yī)院醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的子癇前期患者60例，其中輕度子癇前期30例，重度子癇前期30例。選擇同期正常孕婦30例為對照組。子癇前期組孕婦均因病情需要行剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠，對照組孕婦均因社會因素行剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠。子癇前期的診斷與分類參照謝辛主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]。孕婦年齡、孕產(chǎn)次和孕前BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，重度子癇前期組孕婦孕周與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。所有病例均無其他產(chǎn)科并發(fā)癥及內(nèi)外科合并癥。胎盤組織標(biāo)本經(jīng)患者獲取知情同意書后進(jìn)行。

Table 1 Clinical characteristics of all participants

Note:*compared to control,P< 0.05

二、研究方法

1.標(biāo)本采集

胎盤娩出5 min內(nèi)取胎盤標(biāo)本，在胎盤中央母體面靠近臍帶血管處(避開出血、梗死和鈣化區(qū))，取胎盤組織塊大小約2 cm × 2 cm ×2 cm，一塊用生理鹽水漂洗后，置于無RNA酶的無菌凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存；另一塊用 10% 中性福爾馬林液固定，制備石蠟切片。

2.qRT-PCR定量檢測胎盤組織α7nAChR mRNA的表達(dá)

按Trizol 試劑的使用操作步驟提取胎盤組織總RNA，進(jìn)行RNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度。以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，按照 Thermo公司 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書，將各樣本總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著應(yīng)用 SYBR Green I 熒光染料技術(shù)行實時定量 PCR 反應(yīng)， 以 cDNA 為模板，建立RT-qPCR 反應(yīng)體系，總的反應(yīng)體積是20 μl。α7nAChR的TaqMan探針由北京君諾德生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成引物，α7nAChR上游引物序列5′- TTT CGT TTC ATG CAC TGG ACC CC-3′，下游引物序列5′- GGT TGC GAT TGG CGA ACC TGT TC-3′；β-actin上游引物序列5′- CCC AGA ATC TAC TAT CAC GAG TAC GAC GC -3′，下游引物序列5′- AAT CAC GAC GAT CGC ATA TTT ACG CAA CA-3′。根據(jù)PCR 產(chǎn)物熔解曲線的平均熔解溫度確定產(chǎn)物的純度。以Ct 值校正目的基因Ct 值,實驗結(jié)果采用2﹣ΔΔCt法,計算目的基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的差異。

3. Western-blot法檢測胎盤α7nAChR蛋白的表達(dá)

嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取胎盤總蛋白，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對照，酶標(biāo)儀檢測OD值，計算蛋白濃度。經(jīng)SDS PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜后在封閉液中封閉2小時，隨后加入1∶800一抗孵育24 h ，二抗孵育1∶1000 2 h，漂洗濾膜后加入DAB顯色劑顯色，晾干硝酸纖維素膜，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照，結(jié)果用Image J軟件分析，以目的條帶密度與β-actin光密度比值作為目的條帶的相對參數(shù)。

4.免疫組化方法檢測胎盤組織NF-κB的蛋白表達(dá)

將石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化，并進(jìn)行抗原修復(fù)，加入內(nèi)源性過氧化氫阻斷劑孵育10 min，隨后加入1∶200兔抗人NF-κB65 37℃孵育60 min，再滴加增強1∶500酶標(biāo)山羊抗兔 IgG聚合物孵育20 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。NF-κB陽性表達(dá)的判定：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中染有棕黃色、褐色顆粒，計算陽性細(xì)胞百分比評分，5%為0分，5%～20%為1分，20%～50%為2分，50%～75%為3分，75%為4分；無著色0分，淺黃色1分，黃色2分，深黃色3分。兩者相乘，0分為陰性，1～4分為+，5～8分為++，9～12 分為+++，++，+++均視為陽性。

5.胎盤組織中白介素6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)蛋白的檢測

采用雙抗體夾心ELISA法測定母血中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)。ELISA試劑盒購自南京巴傲得生物科技有限公司。操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。所有樣品均設(shè)立復(fù)孔，均在同一批內(nèi)檢測。

6.統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1.α7nAChR mRNA和蛋白在胎盤組織中的表達(dá)

輕度子癇前期組胎盤組織中α7nAChR mRNA的表達(dá)水平 (1.31 ± 0.12) 明顯高于對照組和重度組 (0.62 ± 0.10；0.41 ± 0.08)，而重度組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。α7nAChR蛋白在輕度子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)水平(0.78± 0.11)高于對照組和重度組 (0.36 ± 0.07；0.20 ± 0.06)，與對照組相比較，重度組的α7nAChR蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)，見圖1和圖2。

2.免疫組化檢測NF-κB蛋白胎盤組織的表達(dá)結(jié)果

NF-κB65主要表達(dá)于胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、少量間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，輕度子癇前期胎盤組織中的NF-κB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，其NF-κB陽性表達(dá)率為 56.7%(17/30)，高于對照組中的表達(dá)率26.7% (8/30)，存在統(tǒng)計學(xué)差異 (χ2=11.286，P<0.01)。重度子癇前期的NF-κB蛋白陽性表達(dá)率為83.3%(25/30)，與輕度子癇前期組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.464，P<0.01)，見表2和圖3。

Note:*compared to control，P<0.05; **compared to control，P<0.01; ##compared to mild preeclampsia，P<0.01Figure 1 Expression ofα7nAChR mRNA in the placenta

Note: *compared to control，P<0.05; **compared to control，P<0.01; ##compared to mild preeclampsia，P<0.01Figure 2 Expression of α7nAChR protein in the placenta

Table2Expression of NF-κB in distinct histological placental tissue

GroupNNF-κBnegative (-)positive (+)Control30228Mild preeclampsia**301317Severe preeclampsia##30525

Note:**compared to control，P<0.01;##compared to mild preeclampsia，P<0.01

3. ELISA法測定胎盤組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)變化。

IL-6和TNF-α在子癇前期患者胎盤組織中的水平高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，重度子癇前期組IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯高于輕度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

Figure 3 Expression ofNF-κB protein in placentaNote:Immunohistochemistry analysis of NF-κB from placenta in preeclampsia (SP, × 200)(A:control group, B:mild preeclampsia; C:severe preeclampsia)

GroupN IL-6 TNF-αControl3028.12±9.1749.31±8.83Mild preeclampsia3037.65±11.34*60.12±10.16**Severe preeclampsia3063.42±8.21**/##80.55±12.14**/##

Note:*compared to control，P<0.05;**compared to control，P<0.01;##compared to mild preeclampsia，P<0.01

Figure 4 Possible mechanisms of cholinergic anti-inflammatory pathways in preeclampsia

討 論

子癇前期是妊娠特有多系統(tǒng)受累的疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一[5]。近年來研究顯示子癇前期具有前炎性因子如細(xì)胞因子、趨化因子等過度表達(dá)的特征[6]。許多學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)在子癇前期病理過程以及胎兒宮內(nèi)生長受限，HELLP綜合征發(fā)揮著重要作用。膽堿能抗炎通路 (cholinergic anti-inflammatory pathways，CAP) 是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在一條能夠拮抗炎癥反應(yīng)的通路，主要由迷走神經(jīng)、ACh和α7-nAchR亞型構(gòu)成，其機(jī)制為大腦識別傳入迷走神經(jīng)傳來的信號，刺激迷走神經(jīng)末梢釋放Ach，與免疫細(xì)胞上表達(dá)的α7-nAchR結(jié)合，抑制致炎細(xì)胞因子的合成與釋放，從而發(fā)揮抗炎作用[7]。

1986年Satyanarayana學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)中度變性(如子癇前期、子癇和胎死宮內(nèi))，并伴有Ach合成表達(dá)明顯減少。Murthy等[9]通過測定子癇前期患者胎盤組織中的Ach水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其Ach釋放明顯減少。據(jù)此，我們推測作為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的“膽堿能抗炎通路”可能參與其中。由Ach激活的α7nAChR是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性分子[10]。體外研究顯示：α 7nAChR受體在人臍靜脈和微血管的內(nèi)皮細(xì)胞上有著豐富的表達(dá)。但在缺氧、煙堿刺激后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞α 7nAChR水平明顯升高[11]。但也有學(xué)者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血缺氧狀態(tài)下，α7nAChR蛋白的表達(dá)下降[12]。本研究結(jié)果顯示，α7nAChR mRNA在正常孕婦和子癇前期患者胎盤組織中均有表達(dá)，輕度子癇前期孕婦胎盤組織中α7nAChR mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組。有趣的是，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)重度子癇前期組的α7nAChR mRNA與輕度子癇前期組相比明顯下降，且重度組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時Western-blot檢測結(jié)果也證明與mRNA結(jié)果相一致，由以上研究可以推測能與Ach相結(jié)合的煙堿受體可能在子癇前期的發(fā)病過程中起一定作用。但與Rita Machaalani[13]等的結(jié)果并不一致，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)子癇前期組中α7nAChR mRNA表達(dá)更高。分析認(rèn)為這可能與作者未將子癇前期進(jìn)行分類，如輕度型或重度型，及子癇前期狀態(tài)下缺血缺氧的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間等有關(guān)。

NF-κB是炎癥因子基因表達(dá)的樞紐之一，被稱為前炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，激活諸如IL-1β、IL-6和TNF-α等的其他促炎細(xì)胞因子并擴(kuò)增其他炎性介質(zhì)，引起廣泛的過度性炎癥反應(yīng)[14]。2001年Takcas就通過研究發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病患者的血漿可使NF-κB激活，且比正常妊娠組孕婦的活性增加2.5倍[15]。大量的研究表明，CAP是通過α7nAChR介導(dǎo)的抗炎通路抑制NF-κB途徑完成的[16]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者胎盤NF-κB蛋白表達(dá)較正常妊娠組顯著上調(diào)，且重度組的NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于輕度組。我們進(jìn)一步測定胎盤組織IL-6和TNF-α的水平，發(fā)現(xiàn)子癇前期組的IL-6和TNF-α水平明顯高于正常妊娠組，且重度組明顯高于輕度組，與之前的研究結(jié)果相一致[17]，提示炎癥因子激活參與了子癇前期病理生理過程，其表達(dá)強弱可以在一定程度上顯示子癇前期發(fā)生發(fā)展的嚴(yán)重程度。

子癇前期是個多因素、多機(jī)制的疾病，機(jī)體表現(xiàn)的炎癥反應(yīng)是一種復(fù)雜、交叉調(diào)節(jié)、互相協(xié)調(diào)的過程，并且與氧化應(yīng)激反應(yīng)密不可分[18]，作用機(jī)制見圖4。本研究結(jié)果顯示輕度子癇前期狀態(tài)下，機(jī)體代償性激活膽堿能抗炎通路，α7nAChR表達(dá)增多，抑制NF-κB的激活，一定程度上抑制炎癥反應(yīng)。因此輕度子癇前期組的IL-6、TNF-α的表達(dá)雖然高于正常妊娠組，但明顯低于重度子癇前期組。當(dāng)進(jìn)展到重度子癇前，局部胎盤組織存在氧化與抗氧化的失衡，而氧化應(yīng)激導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤及T細(xì)胞活化，加重炎癥反應(yīng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，使機(jī)體代償調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，引起母體免疫損傷，導(dǎo)致膽堿能抗炎通路受損，使膽堿能系統(tǒng)出現(xiàn)異常，α7nAChR表達(dá)減少甚至丟失，失去對NF-κB信號通路的抑制作用，使NF-κB表達(dá)增多，釋放大量的毒性因子如炎性介質(zhì)，使血管出現(xiàn)嚴(yán)重狹窄及重鑄障礙。

目前，治療子癇前期的唯一有效方式是終止妊娠。經(jīng)證實，采用電刺激迷走神經(jīng)和激活a7nAchR等方法激活膽堿能抗炎通路，對膿毒癥、缺血再灌注損傷、呼吸機(jī)引起的急性肺損傷、結(jié)腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病均有良好的保護(hù)作用。Liu Y等[19]研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可通過激活CAP，抑制NF-κB等炎癥因子的產(chǎn)生，且該作用與α7nAChR通路有關(guān)，認(rèn)為膽堿能受體激動劑，如尼古丁等可通過抑制NF-κB的表達(dá)從而預(yù)防子癇前期發(fā)生發(fā)展。根據(jù)本研究的結(jié)果展開對電刺激迷走神經(jīng)和a7nAchR激動劑的進(jìn)一步研究，可能對子癇前期的發(fā)病機(jī)制以及防治提供新思路。