胃癌個體化免疫治療新策略研究

張啟德，葛蓉，王建寧

腫瘤免疫治療已成為繼手術、放化療治療后第4大腫瘤療法之一[1]。目前應用最廣泛的免疫檢查點抑制劑，包括CTLA-4、PD-1及其配體PD-L1抑制劑。惡性腫瘤及其微環(huán)境中過度表達的程序性死亡配體-1(programmed death ligands 1，PD-L1)與程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)結(jié)合，激活下游通路，下調(diào)抗腫瘤免疫反應，使腫瘤逃逸人體免疫監(jiān)視及殺傷，促進腫瘤生長。PD-1及PD-L1在多種胃腸道惡性腫瘤中上調(diào)，阻斷PD-1/PD-L1信號通路為腫瘤免疫治療提供可能[2]。胃癌作為我國常見惡性腫瘤之一，其預后也與細胞錯配修復功能缺失有關[3]。目前已發(fā)現(xiàn)錯配修復基因有多種，錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1參與DNA錯配修復過程，是其中關鍵蛋白[4]。因此了解胃癌患者PD-1、PD-L1和錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達與腫瘤臨床病理特征的關系，可能為臨床選擇應用PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療優(yōu)勢人群提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標本 收集南京市江寧醫(yī)院2015年1月至2016年12月，胃癌根治術后組織學證實為胃癌的石蠟標本76例。所有標本均經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，制成5 μm切片、HE染色后，由兩位具有高級職稱的病理醫(yī)師進行病理學診斷。

1.2 免疫組化法檢測PD-L1、PD-1和錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1蛋白表達 免疫組化過程按照PV-9000試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、3% H2O2避光孵育10 min，PBS緩沖液清洗3次，加入一抗PD-L1、PD-1、hMSH2或hMLH1(均購于英國Abcam公司)，1∶100稀釋，PBS作空白對照；4 ℃冰箱過夜，37 ℃復溫60 min，應用DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 免疫組化標本由兩位高級職稱病理科醫(yī)師獨立閱片判定。PD-L1和PD-1蛋白定位于細胞質(zhì)或細胞膜，hMSH2 和hMLH1蛋白定位于細胞質(zhì)或細胞核，陽性染色為黃至棕褐色顆粒。均采用二次計分法：每例標本隨機計數(shù)5個高倍視野(×400)觀察并計數(shù)陽性染色細胞及其百分比。染色強度分級：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞密度分級：陽性細胞數(shù)<10%為1分，陽性細胞數(shù)10%～50%為2分，陽性細胞數(shù)>50%為3分。兩項得分相乘結(jié)果≥3分為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphpadPrism 6統(tǒng)計軟件進行分析，組間差異比較應用χ2檢驗，采用Spearman等級相關分析胃癌組織中PD-L1、PD-1與錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達的相互關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織PD-L1、PD-1、hMSH2、hMLH1蛋白表達與臨床病理特征的關系 胃癌組織中，PD-L1蛋白表達陽性率為47.37%(36/76)，其表達與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及脈管癌栓有關，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者PD-L1表達高于Ⅰ、Ⅱ期者(P<0.05)，腫瘤低分化者PD-L1表達高于中分化及高分化者(P<0.05)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于未轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，而有脈管癌栓者高于無脈管癌栓者(P<0.05)，見表1。

胃癌組織中，PD-1蛋白表達陽性率為39.47%(30/76)，其表達與各臨床病理特征均無關(均P>0.05)。胃癌組織中錯配修復基因hMSH2 表達陽性率為35.53%(27/76)，hMLH1表達陽性率為38.16%(29/76)，兩者表達均僅與TNM分期相關，Ⅲ、Ⅳ期表達高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，見表1。

2.2 胃癌中PD-L1、PD-1與錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達的相關關系 應用Spearman等級相關分析法對PD-L1、PD-1與錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達水平之間的關系分析顯示，76例標本中，PD-L1與hMSH2、hMLH1蛋白表達呈正相關(均P<0.05)，而PD-1與PD-L1、hMSH2 、hMLH1蛋白表達均無相關(均P>0.05)，見表2、表3。

表1 胃癌組織PD-L1、PD-1和錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達與腫瘤組織病理的關系

表2 胃癌組織中PD-L1、PD-1和hMLH1、hMSH2表達水平的相關關系

表3 胃癌組織中PD-L1和PD-1表達水平的相關關系

3 討論

近年來，免疫治療特別是免疫檢查點調(diào)節(jié)免疫治療取得較大進步，PD-1、PD-L1免疫檢查點抑制劑在多種進展期腫瘤中得到應用。PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的負性共刺激信號分子之一，腫瘤組織中淋巴細胞，尤其是活化T細胞均能檢測到PD-1蛋白表達。PD-L1與T細胞表面受體PD-1結(jié)合后，抑制T細胞活化，誘導抗腫瘤T細胞凋亡，最終是機體抗腫瘤效應降低，引起腫瘤進展。然而，PD-1/PD-L1抑制劑在不同腫瘤的應用結(jié)果表明，PD-L1在腫瘤或免疫細胞的表達雖重要，但并非絕對的療效預測性生物標志[5-6]。更進一步研究表明，PD-1免疫檢查點抑制劑pembrolizumab可選擇性延長存在基因錯配修復基因缺陷的直腸癌患者生存期[7]。錯配修復基因缺陷常導致錯配修復蛋白表達下降，引起細胞DNA錯配無法修復，進而發(fā)生細胞惡變產(chǎn)生腫瘤[8]。胃癌組織中，PD-L1與PD-1表達相關性尚無定論。本研究結(jié)果表明，PD-L1與PD-1表達無相關，PD-1表達與多項臨床病理特征無相關，這可能與腫瘤微環(huán)境中存在其他負向免疫調(diào)節(jié)分子有關[9]。PD-L1表達與總生存期有關，近年來有研究顯示，PD-L1在腫瘤表達可作為判斷患者預后的重要指標[10]。本研究結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達與腫瘤組織病理特征相關，胃癌組織PD-L1表達與性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無相關，與腫瘤分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯相關，低分化、分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓的PD-L1陽性表達率最高，表明PD-L1在惡性程度較高、預后較差的腫瘤組織中表達增高。

Keynote-012研究表明，PD-1抗體Pembrolizumab治療PD-L1陽性晚期胃腺癌安全有效，將PD-L1陽性作為篩選目標，可選擇從PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療中獲益的人群[11]。然而研究表明，雖然PD-1抑制劑治療非小細胞肺癌、黑素瘤及腎癌客觀反應率為6%～17%，疾病穩(wěn)定時間可長達2年，但PD-1抑制劑在其他組織學類型，如胃腸腫瘤和膽胰腫瘤的治療作用卻微不足道[12]。這一現(xiàn)象提示，對于PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑可能存在部分敏感人群，尋找PD-L1以外新的生物標志物可更好預測其療效。一項PD-1抑制劑前瞻性試驗表明，PD-1抑制劑對于錯配修復基因缺陷的腸癌能取得良好療效，MMR缺陷腸癌組的客觀緩解率及無進展生存期顯著高于MMR正常腸癌組，包括胃癌在內(nèi)的其他MMR缺陷的腫瘤組客觀緩解率也高達60%。研究發(fā)現(xiàn)，在MMR缺陷腫瘤組，雖然PD-L1表達仍顯著，但PD-L1表達并不與治療反應獨立相關。提示PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑應用對象的選擇需從腫瘤類型向分子特征轉(zhuǎn)變[5]。目前對MMR缺陷的檢測僅限于懷疑Lynch綜合征患者或者早期結(jié)腸癌患者，因為MMR缺陷常預示更好預后，部分腸癌患者可避免輔助化療[13]。研究表明，PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑對于MMR缺陷腫瘤廣泛有效，后續(xù)臨床中可擴大對MMR缺陷的檢測范圍。腫瘤組織中錯配修復基因缺陷導致錯配修復蛋白表達或功能下降。本研究中，我們同時檢測了腫瘤組織PD-L1及錯配修復過程中關鍵蛋白hMSH1、hMLH2表達，表明錯配修復蛋白表達與腫瘤臨床分期相關，錯配修復蛋白表達與PD-L1呈正相關。這一結(jié)果與上述前瞻性試驗不完全一致，可能與樣本量不大且分別從基因和蛋白水平檢測有關，后續(xù)研究中，我們需完善基因水平的微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測，以進一步證實實驗結(jié)果。

綜上所述，PD-L1表達與多種胃癌臨床病理特征相關，隨著胃癌病情發(fā)展及惡性程度增高，PD-L1表達陽性率逐漸升高。PD-L1表達與錯配修復蛋白表達相關，在應用PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑時同時檢測PD-L1及錯配修復蛋白表達，更有利于預測藥物抗腫瘤效果。