MicroRNAs對(duì)肺癌靶向治療耐藥性的研究進(jìn)展*

張潘紅，邱志宏，崔家駿

（宜春學(xué)院 1.化學(xué)與生物工程學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000）

肺癌是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已處于晚期[1]。具有生物導(dǎo)彈之稱的靶向治療使肺癌的治療獲得很大的進(jìn)步，但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，肺癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響肺癌的治療效果[2]。研究發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的MicroRNAs（miRNAs）在肺癌細(xì)胞對(duì)分子靶向藥物產(chǎn)生的耐藥性中發(fā)揮重要作用，是形成耐藥性的潛在靶點(diǎn)[1，3]。因此，迫切需要揭秘miRNAs 在分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥性中的作用。

1 miRNAs 生物學(xué)功能

1993年人類首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)miRNAs，其是一個(gè)長(zhǎng)約20 ～22 個(gè)核苷酸的小分子非編碼片段RNA，幾乎參與每個(gè)細(xì)胞生物過程，比如細(xì)胞的增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)移、新陳代謝及死亡等，對(duì)動(dòng)物發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持也起到至關(guān)重要的作用。miRNAs 生物發(fā)生因子Dicer 9 和Drosha 10 的缺失，是小鼠胚胎致死的重要危險(xiǎn)因素[2，4]。AGO 是一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族，主要以單鏈小核酸為作用靶點(diǎn)，誘導(dǎo)RNA或DNA 中的互補(bǔ)序列發(fā)生沉默[5]。miRNAs 主要通過誘導(dǎo)AGO 蛋白與mRNA 的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，形成miRNAs 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，促進(jìn)mRNA 的降解和翻譯抑制[6-7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 的功能失調(diào)與人類許多疾病發(fā)生和腫瘤細(xì)胞耐藥性形成密切相 關(guān)[8]，例如根據(jù)不同作用靶點(diǎn)，miRNAs 可作為癌基因或腫瘤抑癌基因在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展惡化中發(fā)揮作用[9]。目前，一些miRNAs 已成為診斷癌癥、判斷癌癥患者預(yù)后及新型癌癥治療的靶標(biāo)[10]。

2 miRNAs 與肺癌靶向藥物耐藥性的關(guān)系

2.1 miRNAs 與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑的關(guān)系

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是ErB/HER 酪氨酸激酶受體家族成員之一，其與配體結(jié)合后，導(dǎo)致重要的構(gòu)象變化，引起細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、凋亡及轉(zhuǎn)移。EGFR 突變存在于許多惡性腫瘤中，是預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者治療反應(yīng)的突出指標(biāo)[11]。吉非替尼和厄洛替尼是第一代EGFR-酪氨酸激酶抑制 劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）最具代表性的藥物，主要針對(duì)具有EGFR 突變的肺腺癌患者，通過阻斷三磷酸腺苷與胞內(nèi)酪氨酸激酶的結(jié)合，抑制酪氨酸殘基磷酸化，阻止下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。常與西妥昔單抗聯(lián)合治療EGFR 功能突變的肺腺癌，效果顯著，但最終會(huì)因耐藥性的產(chǎn)生，削弱這類藥物的細(xì)胞殺傷作用，導(dǎo)致靶向治療失敗[12]。

異常表達(dá)的miRNAs 與肺腺癌細(xì)胞EGFR 突變有關(guān)，嚴(yán)重影響肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，參與肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs 耐藥性的調(diào)節(jié)。2009年CHOW 等[13]對(duì)10例非吸煙患者肺腺癌組織和癌旁正常肺組織進(jìn)行miRNAs 基因芯片和qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)miR-145、Let-7 及miR-126 在肺腺癌中低表達(dá)。EGFR基因序列分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10例肺腺癌中有7例存在EGFR突變。轉(zhuǎn)染細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞、無EGFR突變細(xì)胞及EGFR突變細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染3 種miRNAs 前體，結(jié)果EGFR突變細(xì)胞的存活率降低40%，而其他兩組細(xì)胞存活率無變化。這些結(jié)果證實(shí)miR-145、Let-7 及miR-126 對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。2011年CHOW 等[14]又通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-145 表達(dá)下調(diào)與肺腺癌細(xì)胞EGFR突變有關(guān)，且異常表達(dá)的miR-145 可通過抑制靶基因EGFR的表達(dá)，提高吉非替尼的細(xì)胞毒性作用，抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。同樣以EGFR為靶基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的還有miR-146a，其可通過靶向EGFR，抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，還可增強(qiáng)NSCLC 中EGFR 酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體的細(xì)胞毒性[15]。

2.2 miRNAs 與抗血管生成劑的關(guān)系

血管生成在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用[16]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是刺激腫瘤血管生成的重要因素，與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是最重要的刺激新生血管形成的因子，在惡性腫瘤中高表達(dá)[17]。因此，如何利用VEGF 阻斷血管形成，抑制腫瘤生長(zhǎng)成為近十年來分子靶向藥物研究的熱點(diǎn)之一[18]。目前，臨床常將抗血管生成素與化療藥物聯(lián)合使用，以提高惡性腫瘤的化療效果，例如貝伐單抗與紫杉醇-卡鉑聯(lián)合治療方案，提高NSCLC 的整體存活率[19]。目前，筆者對(duì)抗血管生成素的研究取得可喜的成績(jī)，但對(duì)VEGF如何阻斷血管形成的具體分子機(jī)制研究，仍然存在很多問題，其中包括miRNAs 對(duì)VEGF 信號(hào)通路的具體作用研究。

VEGF 及其受體FIT-1 和KDR 是形成VEGF 信號(hào)通路的主要成分[20]。CHAN 等[21]于2011年發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的miR-200b 具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成的功能。同年CHOI 等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-200b在順鉑耐藥的肺癌A549 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，使用脂質(zhì)體RNAi MAX 將人工合成的miR-200b 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，VEGF、FIT-1 及KDR 蛋白表達(dá)降低。血管生成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞在基底膜形成毛細(xì)血管的能力也降低。雙熒素酶分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF、FIT-1 及KDR 是miR-200b 的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-200b是通過VEGF 信號(hào)通路發(fā)揮抑制作用。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終證實(shí)，miR-200b 是通過負(fù)調(diào)控VEGF、FIT-1 及KDR 在腫瘤血管形成中發(fā)揮作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-126 也具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，并通過靶向VEGF-A 提高NSCLC 對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性[22]。因此，深入了解miRNAs 與VEGF 信號(hào)通路的關(guān)系不僅有助于抗血管生成劑的研究，而且對(duì)提高腫瘤細(xì)胞藥物敏感性也至關(guān)重要。

2.3 miRNAs 與TRAIL 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抗性的關(guān)系

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族成員之一，也是TNF 家族中抗腫瘤活性最強(qiáng)的因子之一，能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無細(xì)胞毒性，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[23]。TRAIL 與細(xì)胞膜表面的死亡受體TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）相互作用，誘導(dǎo)死亡受體與Fas 蛋白的相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（fas-associated death domain,FADD）結(jié)合，促進(jìn)FADD 與Procaspase-8 結(jié)合，活化凋亡通路關(guān)鍵蛋白Caspase-8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]?；蛘逿RAIL與受體結(jié)合后，經(jīng)TNF 相關(guān)受體-1（tumor necrosis factor receptor-1,TNFR1）、TNFR1 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TNFR1-associated death domains,TRADD）及TNF 受體相關(guān)因子2（TNFR-associated factor 2,TRAF2）激活核因子kB（nuclear factor-kappa B,NF-kB），發(fā)揮促凋亡作用。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用耐藥，且TRAIL 重復(fù)作用導(dǎo)致一些敏感細(xì)胞對(duì)TRAIL 產(chǎn)生獲得性耐藥，成為影響TRAIL 治療效果的主要障礙。

miRNAs 在TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抗性中發(fā)揮重要作用。GAROFALO 等[25]于2008年在TRAIL 耐藥性NSCLC 研究中發(fā)現(xiàn)一種位于X 染色體短臂且具有共同調(diào)控機(jī)制的新型miRNAs：miR-221 和miR-222，并以其作為研究對(duì)象，探索TRAIL 耐藥性機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，與TRAIL 敏感的H460 細(xì)胞系相比，miR-221 和miR-222 在TRAIL 耐藥細(xì)胞、中度耐藥的A459 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中表達(dá)升高。轉(zhuǎn)染miR-221和miR-222 抑制劑后，TRAIL 耐藥細(xì)胞對(duì)TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，而轉(zhuǎn)染miR-221 和miR-222 前體的TRAIL 敏感細(xì)胞，則對(duì)TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡失敏，出現(xiàn)耐藥表型。同時(shí)使用寡核苷酸芯片技術(shù)對(duì)TRAIL 耐藥細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白Kit 和P27kip 表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步的深入研究最終證實(shí)，miR-221 和miR-222 是通過抑制關(guān)鍵蛋白Kit和P27kip 的表達(dá)，破壞腫瘤細(xì)胞中TRAIL 的功能，抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated signal kinases,ERK1/2）的激活在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。GIULIA 等[26]于2012年在NSCLC 中發(fā)現(xiàn)miR-494 受ERK1/2 調(diào)節(jié)，抑制ERK1/2，miR-494 表達(dá)降低，BIM 表達(dá)增加。并證實(shí)異常表達(dá)的miR-494 通過下調(diào)BIM 的表達(dá)，抑制TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.4 miRNAs 與ALK-TKIs 抑制劑的關(guān)系

2.4.1 間變淋巴瘤激酶基因突變 在NSCLC 中，4% ～7% 患者存在間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因重排現(xiàn)象，也稱ALK突變[27]。該突變發(fā)生在2 號(hào)染色體短臂，常與棘皮類微管相關(guān)樣蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like4,EML4）基因結(jié)合，形成具有癌基因特性的EML4-ALK[28]?？诉蛱婺崾堑谝淮诜男》肿娱g變淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKIs），廣泛應(yīng)用于ALK 突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC 患者，效果比傳統(tǒng)的化療藥物好，且對(duì)ROS1基因重排的NSCLC 患者也有很好的效果[29]。但在長(zhǎng)期的治療過程中，肺癌細(xì)胞對(duì)克唑替尼產(chǎn)生的獲得性耐藥，大大降低克唑替尼的抗腫瘤作用。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-200 家族與許多類型腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，miR-200c 是miR-200 家族的重要成員，在許多惡性腫瘤組織中低表達(dá)[30]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）具有促進(jìn)腫瘤免疫抑制和胚胎發(fā)育期組織重塑的作用，還參與組織愈合和器官纖維化，是腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲中必不可少的早期步驟[31]。2008年GREGORY 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-200c 可通過介導(dǎo)靶基因ZEB1和SIP1的表達(dá)抑制EMT。同年P(guān)ARK 等[33]也發(fā)現(xiàn)，miR-200 家族通過介導(dǎo)靶向E-鈣黏蛋白抑制因子ZEB1和ZEB2調(diào)節(jié)EMT，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。2016年GAO 等[34]再次證實(shí)，ZEB1是miR-200c 調(diào)節(jié)EMT 的直接靶基因，并且發(fā)現(xiàn)miR-200c 在克唑替尼耐藥細(xì)胞（NCI-2228/CRI）中表達(dá)降低。為揭秘miR-200c 和EMT對(duì)ALK突變的肺癌細(xì)胞產(chǎn)生克唑替尼耐藥性的影響， GAO 等[34]將miR-200c 模擬物轉(zhuǎn)染入NCI-2228/CRI中，通過qRT-PCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-200c 表達(dá)增加，間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白及CD24 的表達(dá)降低，表明高表達(dá)的miR-200c逆轉(zhuǎn)EMT；同時(shí)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NCI-2228/CRI對(duì)克唑替尼重新致敏。這些結(jié)果最終證實(shí)，miR-200c通過抑制靶基因ZEB1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)EMT，提高克唑替尼耐藥的ALK 突變肺癌細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性[32-34]。此外，miR-150 增強(qiáng)克唑替尼耐藥性骨肉瘤細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性，提高克唑替尼的抗腫瘤作用[35]。

2.4.2 ROS原癌基因1重排ROS原癌基因1（ROS proto-oncogene 1,ROS1）重排非常罕見，約占0.6% ～1.8% NSCLC 患者[36]。1987年BIRCHMEIER等[37]在45 種不同人類細(xì)胞系的調(diào)查研究中，首次在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)ROS1基因重排。2007年RIKOVA 等[38]在肺腺癌中同樣發(fā)現(xiàn)位于染色體6q22位點(diǎn)的ROS1基因重排，該基因能編碼一種屬于胰島素受體家族的受體酪氨酸激酶。研究發(fā)現(xiàn)，ROS1與ALK具有部分同源性，重排的ROS1基因以與ALK 異常激酶活性相似的方式，激活致癌途徑下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡[39-40]。SHAW等[41]在對(duì)50例晚期NSCLC 患者使用克唑替尼治療效果的評(píng)估中發(fā)現(xiàn)，克唑替尼對(duì)ROS1基因重排陽(yáng)性的NSCLC 患者顯示出很好的治療效果，證實(shí)克唑替尼可通過瞄定ROS1基因重排，實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS1基因重排陽(yáng)性NSCLC 患者的靶向治療。

YAN 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 中，與鄰近正常的肺組織相比，miR-760 表達(dá)降低，ROS1 介導(dǎo)的蛋白表達(dá)升高，且兩者呈負(fù)相關(guān)。隨后將miR-760 模擬物轉(zhuǎn)染入A459 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-760 抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。通過TargetScan 系統(tǒng)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，ROS1基因是miR-760 的直接靶基因。為進(jìn)一步確定miR-760 是通過介導(dǎo)靶基因ROS1，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。將ROS1高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入高表達(dá)miR-760 的A549 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的ROS1 促進(jìn)A549 細(xì)胞的增殖，降低miR-760 抑制A549 細(xì)胞遷移的作用。這些結(jié)果最終證實(shí)，miR-760 通過靶向ROS1抑制NSCLC 的增殖和轉(zhuǎn)移。但至今為止，并沒有關(guān)于miRNAs 與ROS1基因重排的NSCLC 對(duì)克唑替尼耐藥的研究報(bào)道。因此，未來研究miRNAs 在肺癌細(xì)胞對(duì)ALK-TKIs 耐藥性中的作用，將有望成為治愈ALK 陽(yáng)性和ROS1基因重排的NSCLC 的新靶點(diǎn)。

3 展望

近年來，隨著人們對(duì)肺癌分子生物學(xué)和基因組學(xué)的不斷深入研究，越來越多的新靶向治療藥物應(yīng)用于肺癌，使肺癌的治療獲得很大的進(jìn)步。但由于分子靶向藥物耐藥性的出現(xiàn)，肺癌仍然是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。然而，miRNAs 與肺癌治療進(jìn)展和肺癌細(xì)胞耐藥性之間的復(fù)雜關(guān)系，為學(xué)者攻克分子靶向藥物耐藥性提供了幫助；為完善分子靶向治療和分子靶向藥物的開發(fā)，指明了新方向。目前，筆者在miRNAs 與肺癌治療進(jìn)展和肺癌靶向藥物耐藥性方面的研究取得豐碩的成果，但仍然存在一些研究空白，比如miRNAs 在NSCLC 對(duì)ALK-TKIs 耐藥性的研究。這些研究的空白，是激勵(lì)學(xué)者不斷研究探索miRNAs奧秘的動(dòng)力，揭秘miRNAs 在肺癌治療進(jìn)展中的重要作用；同時(shí)也是ALK-TKIs 抗性NSCLC 患者治愈的希望。未來如何更好地利用具有逆轉(zhuǎn)耐藥性的miRNAs，抑制那些誘導(dǎo)靶向藥物耐藥性的miRNAs，是正確選擇個(gè)體化治療的重要一環(huán)；也是提高肺癌患者對(duì)靶向藥物利用率，減輕患者痛苦、延長(zhǎng)患者生命的鑰匙。