APOBEC3C的研究進展①

吳小霞

(瓊臺師范學院數(shù)理系，海口 571100)

載脂蛋白BmRNA編輯催化樣蛋白3(The apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3，APOBEC3，A3)家族有七個成員，包括APOBEC3A(簡稱A3A)、APOBEC3B(簡稱A3B)、APOBEC3C(簡稱A3C)、APOBEC3D(簡稱A3DE)、APOBEC3F(簡稱A3F)、APOBEC3G(簡稱A3G)及APOBEC3H(簡稱A3H)，均對ssDNA(single-strand DNA，單鏈DNA，簡稱ssDNA)有胞嘧啶脫氨酶活性，可抑制宿主體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄元件、逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他一些產(chǎn)生ssDNA中間體的DNA病毒的復制[1-7]。

A3C是人類A3家族中幾乎沒有抗病毒和抗逆轉(zhuǎn)錄元件功能的成員。在比較人類七個A3蛋白抗慢病毒及逆轉(zhuǎn)錄元件功能的研究中也發(fā)現(xiàn)，A3C確實是唯一一個功能較弱的成員[1]。

A3C是較弱的人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)抑制因子，但是，A3C卻是強大的抗Vif缺陷的猴免疫缺陷病毒因子(Simian immunodeficiency virus，SIV)。A3C可在HIV-1的靶細胞表達，包括外周血單核細胞、巨噬細胞及胸腺細胞[8]。事實上，A3C可在多種組織表達，也是所有A3基因中表達最豐富的。有研究證實在A3C的表達細胞，Vif表達時能檢測導致病毒多樣性的G→A 突變[2，3，8]，盡管G→A 突變不能抑制病毒復制。

人類A3C具有S188I多態(tài)性，A3CI188增加了蛋白質(zhì)的酶活性及其抑制HIV-1 的能力，A3CS188單體的抗病毒功能雖然不強，但是A3CS188二聚體的抗病毒功能顯著增強，甚至超過了A3CI188，二聚化是決定A3C功能的關(guān)鍵因素。Wittkopp等[1]發(fā)現(xiàn)A3C在靈長類的正選擇下進化，并在A3C:Vif的結(jié)合界面進化，這暗示A3C在病毒防御中起重要作用。人類A3C雖然不能強烈抑制慢病毒復制，但靈長類A3C已作為抗慢病毒蛋白進化，說明A3C是病毒在天然感染過程中必須對抗的重要屏障，對A3C蛋白結(jié)構(gòu)的研究可能在控制病毒感染方面有治療作用[1]。Bourara等[8]發(fā)現(xiàn)利用RNA干擾在Magi細胞抑制內(nèi)源A3C可防止病毒突變，認為A3C引發(fā)的突變導致了病毒多樣性，因此，從免疫抑制或抗逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制方面考慮，發(fā)展抑制A3C的藥物或許是一種新的延遲病毒逃逸的策略?？傊瑢3C研究的深入，可為進一步了解免疫治療并最終治愈相關(guān)疾病帶來希望。

1 APOBEC3C的多態(tài)性

Wittkopp等[1]發(fā)現(xiàn)A3C與其余6個已知功能的A3s在同源的188位氨基酸有差異，A3C在此位置編碼絲氨酸(ser)，其余6個均為保守的異亮氨酸(Ile)。當二者的表達水平相同時，A3CI188抑制Vif缺陷HIV-1(Δvif)感染的能力幾乎是普通A3CS188的十倍[1]。

群體遺傳學顯示人類A3CI188 多態(tài)性是古老的，A3CI188以約10%的頻率出現(xiàn)在不同的非洲人群，而在其他人群卻不出現(xiàn)。研究者們認為可能是在人類進化中188位的異亮氨酸丟失了，但是在人類和黑猩猩距離最近的共同祖先分離之后又被某些人類重新獲得；也可能是I188作為等位基因從未丟失，只是在人類幾百萬年的進化中一直作為一種多態(tài)性存在[1-4]。

Adolph等[4]發(fā)現(xiàn)人類A3C編碼S188I的多態(tài)性增強了蛋白質(zhì)的酶促活性及抑制HIV-1的能力，并使其更易形成二聚體。但是，其他的人科A3C蛋白只有一個不太活躍的S188，就像人類A3C的普通形式一樣。盡管如此，黑猩猩和大猩猩的A3C具有與人類A3CI188幾乎一樣的功能，而且黑猩猩和大猩猩的A3C是在與人類A3CS188I相同的界面形成二聚體，只是利用了不同的氨基酸。最重要的是，每個人科A3C蛋白的二聚化都能增加ssDNA的持續(xù)合成能力，從而導致體外和細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄過程中的大量突變，這是決定A3C功能的關(guān)鍵，因為兩個A3CS188二聚體的抗病毒功能明顯增強，即使與比較活躍的A3CI188相比， A3CS188二聚體的功能也是增強的[1,4]。

2 APOBEC3C的結(jié)構(gòu)

A3蛋白都有1個或2個胞嘧啶脫氨酶域(Cytidine deaminase domains，CDD)。CDD為典型的鋅離子協(xié)調(diào)基序(H-X-E-X23-28-P-C-X-C)，在其活化位點有一個水分子結(jié)合Zn2+而金屬離子被一個組氨酸(His)和兩個半胱氨酸(Cys)協(xié)調(diào)[3,7,9,10]。A3C只有一個CDD。根據(jù)鋅離子協(xié)調(diào)基序進行分類，可將A3分為Z1-A3A家族，包括A3A和A3B及A3G的C-末端域；Z2-A3C家族，包括A3C、A3DE和A3F的C-端和N-端域；A3H是唯一一個Z3鋅指域。A3蛋白以單體、二聚體和寡聚復合物的形式出現(xiàn)[9,10]。

Vasudevan等[7]利用NMR和X-射線晶體結(jié)構(gòu)顯示6個α-螺旋和5個β片層組成的球狀體(α1-β1-β2/2′-α2-β3-α3-β4-α4-β5-α5-α6)是DNA脫氨酶特有的基序。Siriwardena等[7]利用ENDscript 2 software26對比了代表性的A3家族成員的結(jié)構(gòu)并識別出家族常見的結(jié)構(gòu)組成。A3蛋白具有很多反映其序列相似性的二級結(jié)構(gòu)，其三級結(jié)構(gòu)都在中心具有一個被三個螺旋圍繞的β 片層。A3蛋白結(jié)構(gòu)的區(qū)別主要在于A3C、A3F和A3A都具有連續(xù)的β2 鏈，該鏈在A3B和A3G結(jié)構(gòu)中卻被α 螺旋或β轉(zhuǎn)角中斷。

Desimmie等[12]確認A3C的晶體結(jié)構(gòu)形成一個與Vif結(jié)合的凹陷，位于界面的凹陷由A3C疏水性殘基(L72、I79和L80)、芳香族殘基(F75、Y86，F(xiàn)107和H111)和親水性殘基(C76，S81，E106)組成。

也有研究證實不同血統(tǒng)的Vif與A3C有不同的結(jié)合位點，HIV-1的 Vif 對獼猴(rhA3C)、白眉猴(smmA3C)及非洲綠猴的A3C是沒有活性的，rhA3C與 smmA3C上的N/H130 和 Q133殘基是決定其抗HIV-1Vif的重要因素，HIV-1Vif 與hA3C螺旋4連接，與hA3F 不同[13]。

APOBEC家族具有較強的特殊堿基偏好性，位于靶胞嘧啶的5′端而不是3′端。A3G偏好CCC，其他的家族成員以YC(Y是嘧啶)序列為靶，并伴有T作為嘧啶的偏好[5,7,14]。研究證實loop7就是APOBEC酶序列特異性的主要決定因素，loop1、loop3和loop5也與DNA結(jié)合有關(guān)[7]。

Shandilya等[15]發(fā)現(xiàn)與結(jié)合Vif的所有A3s都有一個帶負電荷的表面區(qū)域，而具有催化活性的A3s都在鋅離子調(diào)節(jié)活性位點周圍有一個帶正電的彎曲，這可能是為了適應(yīng)帶負電荷的核酸底物。因此，底物適應(yīng)區(qū)的空間范圍是決定A3s蛋白與Vif結(jié)合及其與底物結(jié)合的關(guān)鍵因素，可以在此進行抗病毒和抗癌癥的治療設(shè)計。

3 APOBEC3C與HIV

HIV基因突變的一個重要機制是逆轉(zhuǎn)錄過程中的G→A突變。G→A突變已在HIV-1感染患者中檢測到至少43%，并且是在持續(xù)復制的環(huán)境下發(fā)生突變[8]。這些突變主要是由DNA編輯酶家族介導，如A3家族。A3蛋白被包裝進入病毒粒子，并在病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄過程中使得負鏈DNA上的胞嘧啶C脫氨基成為尿嘧啶U從而產(chǎn)生無感染性的病毒粒子。A3G引起高頻率的GG→AG突變，A3B和A3F引起GA→AA突變，而A3C主要作用于GA和GG、GA的偏好性強于GG[8]。

A3C也在HIV-1病毒粒子被檢測到，A3C抗HIV-1功能較弱。與A3G相比，A3C誘發(fā)HIV-1DNA上胞嘧啶脫氨基的數(shù)目極少，所以降低了A3C抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄及整合的能力[8]。Wang等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)了決定A3C包裝的HIV組成，即HIV-1 Gag的MA域?qū)ag和A3C之間的相互作用以及A3C的有效包裝非常重要，而HIV-1Gag的NC域，以及減少7SLRNA包裝進入HIV-1病毒粒子并不影響A3C的包裝。Desimmie等[5]證實A3s蛋白共同包裝進入HIV病毒粒子能并發(fā)突變相同的基因組，相互協(xié)作共同抑制HIV復制。

Vasudevan等[16]證實人類A3C.S61P突變增強了SIVΔvif和鼠白血病毒病毒(Murine leukemia virus，MLV)病毒基因組的超突變，卻不能增強HIV-1Δvif的超突變。S61P突變并不能改變A3C的底物特異性、核糖核蛋白蛋白復合物的形成、鋅協(xié)調(diào)或病毒包裝的特點，S(絲氨酸)→P(脯氨酸)誘導的局部結(jié)構(gòu)改變導致了A3C.S61P催化活性的增加[16]，因此，A3C.S61P抗病毒功能的增強與體外胞嘧啶脫氨酶活性有關(guān)。

4 APOBEC3C與其他病毒

慢病毒進化出Vif 蛋白來對抗A3抑制因子，并以多聚泛素化和蛋白酶體降解的方式誘導其降解[1,4,6,7,13,17]。盡管A3C能抑制HIV-1感染的假說仍有爭議[7]。但是，A3C卻能強烈抑制Vif缺陷的SIV[8,16]。

泡沫病毒也進化出了有效的附屬蛋白Bet對抗A3蛋白，泡沫病毒的Bet利用一種不同于Vif的機制抑制了A3C的抗病毒功能，即Bet與A3C形成的復合體抑制A3C的二聚化，卻不能誘發(fā)其降解[2]。

單純皰疹病毒類型1(Herpes simplex virus 1，HSV-1)和愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可能在Hela 細胞容易被A3C編輯，而A3C利用轉(zhuǎn)染實驗過度表達導致HSV-1病毒滴度和感染性的降低[7]。被編輯的EBV DNA也在感染的外周單核細胞系被發(fā)現(xiàn)與A3C的大量表達有關(guān)[7]。

乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染肝細胞導致細胞因子和多種A3蛋白表達[7]。HepG2細胞被共轉(zhuǎn)染進HBV表達質(zhì)粒、編碼融合蛋白核心-A3C以及綠色熒光蛋白GFP的質(zhì)粒。融合蛋白核心-A3C對HBV的DNA水平有實質(zhì)的影響。在表達融合蛋白核心-A3C的HepG2細胞，G→A突變的數(shù)目顯著增加，其他的核苷酸替換比較少。另外，融合蛋白核心-A3C在細胞內(nèi)和細胞培養(yǎng)上清液中也顯著抑制HBV復制[18]。

全基因組測序研究顯示A3特異性的突變標簽在病毒基因組TCW序列背景下是C→U或C→T突變，且常為成簇突變。另外，這些突變簇的TCW序列傾向于在相同的DNA鏈上以C為靶，被稱為鏈協(xié)同突變現(xiàn)象。大約15%～20%的人類癌癥是病毒引起的，這些腫瘤病毒遍布在DNA和RNA病毒家族，包括HPV、EBV和丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)等[7]。

5 APOBEC3C與逆轉(zhuǎn)錄元件

A3C對non-LTR 逆轉(zhuǎn)錄元件都有強大的抑制作用，尤其是長散在細胞核元件(Long-interspersed nuclear element，LINE-1,簡稱L1)和Alu元件[7,18]。

L1約占人類基因組的17%，編碼三個蛋白質(zhì)，即新識別的未知功能的ORF0，具有RNA結(jié)合功能的ORF1P，以及有內(nèi)切酶活性并對L1逆轉(zhuǎn)座具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能的ORF2P，L1已被證實是單基因遺傳病的一個誘因[19,20]。L1編碼的核酸內(nèi)切酶能切除可能導致基因組DNA不穩(wěn)定的雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)[19,20]。

Horn等[19]利用L1核蛋白顆粒的密度梯度離心、L1-ORF1p和A3C的亞細胞共定位以及免疫共沉淀實驗揭示A3C介導的L1抑制機制，即A3C利用RNA依賴的A3C/ORF1p的相互作用抑制L1逆轉(zhuǎn)錄， 但是A3C必須二聚化，RNA結(jié)合凹陷突變R122A可消除APOBEC產(chǎn)生的L1抑制。

6 結(jié)語

A3s家族利用病毒負鏈DNA的C脫氨基作用成為U從而導致病毒失活，并不同程度地抑制了HIV等病毒的復制。與A3家族的其他成員相比，A3C抑制病毒和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件的功能較弱，但是A3C在多種組織的表達卻是所有A3基因中最豐富的。人類A3CI188增加了蛋白質(zhì)的酶活性及其抑制HIV-1 的能力，A3CS188單體的抗病毒功能不強，但是A3CS188二聚體的抗病毒功能明顯增強，甚至超過了A3CI188。A3CI188在非洲人口廣泛分布，是靈長類祖先等位基因，但是在黑猩猩和大猩猩中沒有發(fā)現(xiàn)。當其他原始人類丟失這一抗病毒基因的功能時，一部分人類依然保持或重新獲得作為一個更活躍的抗病毒基因?？傊?，A3C作為病毒天然感染過程中必須對抗的重要屏障，確實與保護宿主抵御慢病毒有關(guān)，對A3C研究的深入，可能會對相關(guān)疾病的治療提供新的思路。