超高壓-限制性酶解法降低豆乳粉致敏性工藝優(yōu)化

江連洲，尋崇榮，綦玉曼，吳長玲，普拉謝克夫?亞歷山大?尤里耶維奇，范志軍，許振國，李 楊，王中江，謝鳳英,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.克麥羅沃國立大學(xué)，俄羅斯 克麥羅沃州 620034；3.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150036；4.山東省高唐藍山集團總公司，山東 聊城 252800）

豆乳粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人體消化吸收，深受消費者的喜愛。目前，傳統(tǒng)濕法工藝制備豆乳粉應(yīng)用較廣[1]，但傳統(tǒng)工藝技術(shù)制得的豆乳粉具有致敏性，致敏蛋白主要是大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、Gly m Bd 30 kDa（P34）和GIy m Bd 28 kDa[2]。目前，酶解是降低大豆致敏性最有效的方法，但酶解的主要缺點是不完全破壞抗原表位且形成強烈的苦味，不利于豆乳粉在國內(nèi)外的市場推廣[3]。

近年來，有利用超高壓處理技術(shù)降低大豆蛋白致敏性，研究表明，相對于其他物理方法，超高壓處理對大豆蛋白致敏性降低率最大[4]。超高壓主要是改變蛋白的三級、四級結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，主要以氫鍵、疏水相互作用維持，改變與過敏相關(guān)的抗原表位，降低致敏性[3,5]。Pe?as等[6]研究表明豆?jié){經(jīng)Corolase PN-L和堿性蛋白酶水解后，不呈現(xiàn)抗原性，但預(yù)實驗表明經(jīng)這兩種酶得到的無致敏性豆乳粉有苦味肽產(chǎn)生，降低豆乳粉的口感。因此本研究以超高壓協(xié)同酶解降低豆乳粉致敏性，改善豆乳粉口感。

李慧靜[4]研究表明超高靜壓可改變蛋白的結(jié)構(gòu)，使大豆分離蛋白柔性結(jié)構(gòu)增加，暴露更多酶切位點，與中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶酶解降低大豆分離蛋白致敏性有協(xié)同作用，且無苦味產(chǎn)生。鄭環(huán)宇[7]及Meinlschmidt[3]等利用超高壓協(xié)助風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白，探討對致敏性的影響，結(jié)果表明超高壓與風(fēng)味蛋白酶酶解具有協(xié)同作用。謝丹丹等[8]利用超高壓協(xié)同木瓜蛋白酶酶解處理南美白對蝦水溶性蛋白，結(jié)果表明高壓可降低蛋白的致敏性，與連續(xù)超高壓直接酶解相比，高壓預(yù)處理后進行酶解有較高的致敏性降低率。白小娟[9]利用超高壓協(xié)同酶解處理大豆分離蛋白，通過對大豆蛋白致敏原P34的降解率進行分析，結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶效果最好，在最優(yōu)工藝條件下（大豆分離蛋白添加量5%、pH 7.5、酶解溫度50 ℃、時間120 min、加酶量1 000 U/g）大豆蛋白致敏原P34的致敏性完全消除。且在最佳超高壓條件下，風(fēng)味蛋白酶酶解效率提高50%。

目前，已有研究報道采用超高壓協(xié)同限制性酶解降低大豆蛋白致敏性，然而將該技術(shù)應(yīng)用到豆乳粉加工中的研究尚鮮見報道。本實驗以傳統(tǒng)濕法加工技術(shù)制備豆乳粉為基礎(chǔ)，利用超高壓協(xié)同限制性酶解以降低豆乳粉致敏性，通過響應(yīng)面法對超高壓-限制性酶解工藝進行優(yōu)化，以得到低致敏性豆乳粉；對豆乳粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)、蛋白質(zhì)體外消化率、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜及感官評價進行分析，為低致敏性豆乳粉的生產(chǎn)加工提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 哈爾濱九三油脂集團；大豆磷脂 周口慧洋飼料有限公司；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g） 黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司；大豆過敏原檢測試劑盒 上海日邦食品有限公司青島分公司；凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)液上海升正公司；考馬斯亮藍（R-250）、胃蛋白酶（782 U/mg）、凝乳酶（40 U/mg）、胰蛋白酶（500 U/mg） 華美生物工程有限公司；實驗所需基礎(chǔ)試劑（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDM-Z80豆?jié){機 上海偉業(yè)儀器廠；Ultra-Turrax T25高速分散器 德國IKA公司；噴霧干燥機 無錫昂益達機械有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SH-1000酶標(biāo)儀 日本Corona Electric公司；垂直板電泳儀 北京六一儀器公司；凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；UHPF-750 MPa-3L超高靜壓設(shè)備包頭科發(fā)公司；高速離心機 德國Eppendorf公司；THZ-80水浴鍋 江蘇電子有限公司；HYP-II八孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動蒸餾器 江蘇省宜興市科教儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 豆乳粉的制備工藝

黃豆→篩選→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣過濾分離→超高壓處理→限制性酶（復(fù)合風(fēng)味蛋白酶）解→滅酶→大豆磷脂調(diào)配→濃縮→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→豆乳粉

參照齊寶坤等[10]的方法，稱量50 g黃豆，浸泡10 h（0.5% NaHCO3溶液），熱燙5 min（沸水），弱堿水磨漿（豆水質(zhì)量比1∶7，pH 6.5～7.0，溫度90 ℃），過濾除去漿渣，對豆乳進行超高壓處理，對超高壓處理后的豆乳溫度和pH值進行調(diào)節(jié)，限制性酶酶解，95 ℃滅酶5 min，混入2%的乳化劑大豆磷脂，真空濃縮（濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%左右即可），均質(zhì)處理后，噴霧干燥（進口溫度185 ℃、出口溫度85 ℃）即得豆乳粉樣品。設(shè)置3 組對照：對照組1：不進行超高壓及酶解處理，其他條件與上述一致；對照組2：只進行酶解處理（酶解時間64 min、酶添加量0.3 U/g），不進行超高壓處理，其他條件與上述一致；對照組3：只進行超高壓處理（超高壓處理溫度50 ℃、超高壓處理壓強320.00 MPa、超高壓處理時間16 min），不進行酶解處理，其他條件與上述一致。

1.3.2 超高壓工藝單因素試驗

保持酶解溫度50 ℃、酶解時間60 min、酶解pH 7.5、酶添加量（以豆乳粉質(zhì)量計）0.3 U/g。在其他條件不變的情況下，分別選取超高壓處理壓強為100、200、300、400、500 MPa，處理時間為5、10、15、20、25 min，處理溫度為10、20、30、40、50、60 ℃進行單因素試驗。通過過敏原含量分析確定超高壓處理工藝單因素最優(yōu)條件。

1.3.3 限制性酶解工藝單因素試驗

保持超高壓處理壓強300 MPa、處理時間15 min、處理溫度50 ℃，在其他條件不變的情況下，分別選取酶解時間20、40、60、80、100 min，酶添加量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/g進行單因素試驗。通過過敏原含量比較分析確定酶解工藝單因素最優(yōu)條件。

1.3.4 超高壓-限制性酶解工藝的響應(yīng)面試驗

以致敏性降低率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗考察超高壓處理壓強、超高壓處理時間、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值、酶添加量對該指標(biāo)的影響規(guī)律。進一步利用Design-Expert軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，選取超高壓處理壓強、超高壓處理時間、酶解時間、酶添加量4 個因素為自變量，以致敏性降低率為響應(yīng)值，設(shè)置4因素3水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface methodology

1.3.5 過敏原含量的測定

1.3.5.1 豆乳粉過敏原的提取

對不同工藝下制備的豆乳粉進行石油醚脫脂處理，記錄脫脂豆乳粉占原豆乳粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；參照李慧靜[4]的方法，稱取3 g脫脂豆乳粉于離心管中，加入57 mL過敏原提取液（0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液），混合均勻，于搖床中室溫振蕩12 h，3 000×g室溫離心20 min，取上清液，用0.45 μm膜過濾，用稀釋緩沖液稀釋20 倍，得到樣品測試液。

1.3.5.2 夾心式酶聯(lián)免疫法測定大豆過敏原含量

參照李慧靜[4]的方法，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定樣品的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定上清液樣品中過敏原含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.045 2X+0.042 8，R2=0.985，其中，Y為大豆過敏原含量/（mg/g），X為樣品測試液于450 nm波長處的吸光度。對照組即1.3.1節(jié)中不進行超高壓及酶解處理的豆乳粉，根據(jù)1.3.5節(jié)的步驟測定過敏原含量。致敏性降低率按式（1）計算：

1.3.6 溶解性的測定

溶解性用蛋白質(zhì)分散指數(shù)表示。參照齊寶坤等[10]的方法，取5 g不同工藝制備的豆乳粉樣品，溶于100 mL去離子水中，攪拌30 min使豆乳粉充分溶解，靜置分層后進行離心（3 000 r/min、10 min），利用凱氏定氮法測定離心后上清液蛋白含量。按式（2）計算蛋白質(zhì)分散指數(shù)（溶解性）：

1.3.7 體外模擬胃腸道消化實驗

參考夏明敬[11]的方法，對豆乳粉中蛋白的消化利用率進行實驗，稱取2 g不同工藝制備的豆乳粉，溶于100 mL去離子水中，在37 ℃的浴鍋中預(yù)熱10 min。用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，加入50 U/g的胃蛋白酶和75 U/g的凝乳酶不斷攪拌水解1 h后，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。然后加入1 000 U/g的胰蛋白酶，不斷攪拌2 h，到時間后經(jīng)沸水浴滅活5 min。取10 mL消化液于燒杯中，加入10 mL的10%三氯乙酸溶液促進蛋白沉淀，然后進行離心處理（4 000 r/min，10 min）[4]。利用凱氏定氮法測定上清液中可溶性蛋白含量。按式（3）計算蛋白質(zhì)消化率：

1.3.8 SDS-PAGE分析

將不同工藝制備的豆乳粉進行石油醚脫脂處理。參考Laemmli等[12]的方法，15%分離膠，5%濃縮膠，將9 mg/mL豆乳粉蛋白樣品與上樣緩沖液（100 mg SDS，0.25 mL β-巰基乙醇，2 mg溴酚藍，2 mL pH 8.0 0.05 mol/L Tris-HCl溶液，甘油2.0 mL，定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL），分別取30、10 μL混合均勻，于95 ℃加熱5 min，上樣量10 μL。電泳過程恒壓，濃縮膠80 V，分離膠120 V。固定液：甲醇-冰乙酸-水體積比為5∶1∶5；染色液：取0.125 g考馬斯亮藍R-250溶于250 mL固定液中；脫色液：甲醇-冰乙酸-水體積比為3∶2∶35。

1.3.9 豆乳粉苦味的感官評價

參考馮學(xué)武[13]的方法，對豆乳粉苦味進行感官評價，由10 人組成評定小組，蒸餾水漱口后，取評定液（豆乳粉與蒸餾水以質(zhì)量比1∶2攪拌混合）3 mL于口中保持10 s，漱口后品嘗標(biāo)準(zhǔn)液（參照Charalambous等[14]方法制備標(biāo)準(zhǔn)液，以奎寧為基準(zhǔn)物設(shè)置苦味上下限，以a（3×10－6mol/L）為下限，以8a為上限，其中a為無苦味、2a為微苦味、4a為中苦味、8a為苦味），如確認兩味道相近，即可將待評定液的苦味值定為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則需取其他標(biāo)準(zhǔn)液再嘗，直至確定苦味值。結(jié)果取10 人評定的平均值[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗進行3 次平行，并將實驗數(shù)據(jù)進行誤差分析。采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖；數(shù)據(jù)及方差分析利用響應(yīng)面分析的Design-Expert軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超高壓處理壓強對降低豆乳粉致敏性的影響

圖1 超高壓處理壓強對豆乳粉致敏性的影響Fig. 1 Effect of UHP pressure on allergenicity of soybean milk powder

由圖1可知，當(dāng)超高壓處理壓強從0 MPa升高到300 MPa時，豆乳粉中過敏原含量隨壓強的增加而顯著減少（P＜0.05），繼續(xù)增加壓強，豆乳粉中過敏原含量變化不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，超高壓處理對限制性酶解降低豆乳粉致敏性有協(xié)同作用，在處理壓強為300 MPa時，豆乳粉過敏原含量最少，降低致敏性效果最好。該結(jié)果與李慧靜[4]、Meinlschmidt等[3]的研究結(jié)果一致，即超高壓處理可降低大豆致敏性，且與限制性酶解有協(xié)同作用。原因是超高壓處理改變了貯藏蛋白的球狀結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，柔性增加，暴露更多酶切位點，促進酶解進行，提高蛋白水解度，降低豆乳粉致敏性[17-18]。Puppo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理壓強高于200 MPa時，可通過非共價鍵斷裂改變7S、11S球蛋白結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)展開[20-21]，Meinlschmidt等[3]的研究表明，超高壓處理壓強高于200 MPa時，水解度顯著提高，進一步證實上述結(jié)論。綜合考慮，選擇最佳超高壓處理壓強為300 MPa。

2.1.2 超高壓處理時間對降低豆乳粉致敏性的影響

圖2 超高壓處理時間對豆乳粉致敏性的影響Fig. 2 Effect of UHP treatment time on allergenicity of soybean milk powder

由圖2可知，當(dāng)超高壓時間由0 min延長到15 min時，豆乳粉中過敏原含量隨著超高壓時間的延長而顯著性減少（P＜0.05），而超過15 min后繼續(xù)延長超高壓時間，過敏原含量有增加趨勢，但變化不顯著（P＞0.05）。原因可能是隨著超高壓處理時間的延長，豆乳中蛋白不斷變性，結(jié)構(gòu)逐漸展開，促進酶解的進行，降低致敏性；但隨著處理時間的繼續(xù)延長，蛋白重新聚集，不利于酶促反應(yīng)的進行，導(dǎo)致過敏原含量增加[4,9]。白小娟[9]的研究表明，超高壓處理時間長于5 min時，大分子蛋白降解，20 kDa的小分子肽增多，說明需要保壓一定時間，蛋白結(jié)構(gòu)才會展開，促進酶解的進行。由李慧靜[4]的研究結(jié)果可知，蛋白的表面疏水性隨時間的延長而增加，超高壓處理時間為15 min時，表面疏水性最大，繼續(xù)延長時間，表面疏水性下降，表明處理時間過長，導(dǎo)致蛋白重新聚集，疏水基團重新包裹于蛋白內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白疏水性下降，進一步證明上述推論。另外處理時間不同，過敏原表位暴露程度不同，導(dǎo)致過敏原含量發(fā)生變化[22]。綜合考慮超高壓能耗成本，選擇最佳超高壓處理時間為15 min。

2.1.3 超高壓處理溫度對降低豆乳粉致敏性的影響

圖3 超高壓處理溫度對豆乳粉致敏性的影響Fig. 3 Effect of UHP treatment temperature on allergenicity of soybean milk powder

由圖3可知，過敏原含量隨超高壓處理溫度的不同有顯著變化（P＜0.05），處理溫度由10 ℃升高到30 ℃時，過敏原含量隨溫度的升高逐漸增加；繼續(xù)升高溫度至50 ℃時，過敏原含量隨溫度的升高而減少，50 ℃時過敏原含量最低；繼續(xù)升高溫度，過敏原含量增加。原因可能是溫度不同，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開程度、柔性蛋白含量及抗原表位暴露程度的不同，對下一酶解工藝的酶促反應(yīng)階段產(chǎn)生不同的影響；溫度變化也可能改變蛋白在乳液油水界面的吸附形式，抗原表位包裹于蛋白分子內(nèi)部，或者破壞蛋白質(zhì)的抗原表位，影響豆乳粉中的過敏原含量[23]。Long Fangyu等[24]研究表明高壓與熱處理有協(xié)同效應(yīng)，在壓力600 MPa、55～75 ℃條件下處理10 min，花生的免疫細胞幾乎完全喪失，進一步證明溫度對蛋白致敏性影響的復(fù)雜性。綜合考慮，選擇最佳超高壓處理溫度為50 ℃。

2.2 限制性酶解工藝單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解時間對降低豆乳粉致敏性的影響

圖4 酶解時間對豆乳粉致敏性的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on allergenicity of soybean milk powder

由圖4可知，當(dāng)酶解時間從0 min延長到60 min時，豆乳粉中過敏原含量顯著減少（P＜0.05），酶解時間為60 min時，豆乳粉中過敏原含量僅為1.21 mg/g，繼續(xù)延長酶解時間，過敏原含量變化不顯著（P＞0.05）。與未酶解的豆乳粉（酶解時間0 min）相比，豆乳粉中過敏原含量顯著下降，說明經(jīng)超高壓處理后酶解可顯著降低豆乳粉致敏性，進一步說明限制性酶解與超高壓對降低豆乳粉致敏性的協(xié)同作用。原因可能是隨著酶解時間的延長，蛋白水解度不斷增加，大分子致敏性蛋白逐漸降解為小分子肽，蛋白致敏性降低；而繼續(xù)延長酶解時間對過敏原含量影響不明顯，可能是因為小分子肽殘存的致敏性不能被酶解消除[9,25]。由白小娟[9]的研究可知，利用風(fēng)味蛋白酶水解大豆蛋白，在水解30 min后，7S及11S致敏蛋白被酶解為小分子肽，而酶解時間延長到60 min后，仍含有部分P34致敏蛋白，進一步證明上述推論。綜合考慮，選擇最佳酶解時間為60 min。

2.2.2 酶添加量對降低豆乳粉致敏性的影響

圖5 酶添加量對降低豆乳粉致敏性的影響Fig. 5 Effect of enzyme concentration on allergenicity of soybean milk powder

由圖5可知，酶解后豆乳粉過敏原含量顯著減少（P＜0.05），與只超高壓處理的豆乳粉相比，過敏原含量減少了42.48%。隨著酶添加量的增加，豆乳粉中過敏原含量逐漸減少，酶添加量為0.3 U/g時，繼續(xù)增加酶添加量，過敏原含量變化不大（P＞0.05）。進一步說明限制性酶解與超高壓在降低致敏性方面的協(xié)同作用，這與Meinlschmidt等[3]及白小娟[9]的研究結(jié)果一致。原因可能是豆乳中酶相對含量增加，促進酶解反應(yīng)進行，豆乳中蛋白的水解度提高，大分子致敏蛋白降解為致敏性較低的小分子肽，降低豆乳粉致敏性[3-5]。由于酶制劑成本較高，綜合考慮，選擇最佳酶添加量為0.3 U/g。

2.3 超高壓-限制性酶解降低豆乳粉致敏性的響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

本試驗利用統(tǒng)計軟件Design-Expert進行響應(yīng)面法過程優(yōu)化，以超高壓處理壓強、超高壓處理時間、酶解時間、酶添加量4 個因素為自變量，以致敏性降低率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，具體試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results for response surface analysis

豆乳粉的致敏性降低率通過Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到二次回歸模型方程為：

R=84.60+10.00A+8.25B+10.33C+13.92D+6.00AB－6.00AC+0.50AD+6.00BC+0.75BD－5.50CD－11.01A2－15.88B2－11.51C2－12.88D2

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression model

由表2、3可知，擬合方程線性關(guān)系顯著，模型回歸項顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），模型擬合度R2為96.57%，為93.13%，表明該模型可有效模擬試驗數(shù)據(jù)，故可利用該模型對響應(yīng)最優(yōu)值進行理論推測。通過F檢驗比較得知各因子貢獻率依次為：D＞C＞A＞B，即酶添加量＞酶解時間＞超高壓處理壓強＞超高壓處理時間。基于響應(yīng)面尋優(yōu)分析確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為超高壓處理壓強320.00 MPa、超高壓處理時間16 min、酶解時間64 min、酶添加量0.3 U/g，致敏性降低率最優(yōu)值為88.35%。

圖6 兩因素交互作用對豆乳粉致敏性降低率影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on percent reduction in soybean milk powder allergenicity

為適應(yīng)生產(chǎn)，將制備條件優(yōu)化為超高壓處理壓強320.00 MPa、超高壓處理時間15 min、酶解時間60 min、酶添加量0.3 U/g，此條件下豆乳粉的致敏性降低率為88.09%，說明響應(yīng)值的實驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。由感官評價的結(jié)果可知，此條件下得到的豆乳粉有微苦味，以豆乳粉-木糖醇質(zhì)量比為1∶3調(diào)配后，豆乳粉沒有苦味，為低致敏性豆乳粉的加工推廣提供實驗參考。

2.4 不同工藝豆乳粉溶解性、蛋白質(zhì)消化率及過敏原含量的對比分析

圖7 不同豆乳粉的溶解性、蛋白消化利用率及過敏原含量Fig. 7 Protein dispersibility indexes, protein digestibility and allergen contents of different soybean milk powders

由圖7可知，與傳統(tǒng)濕法工藝相比，經(jīng)超高壓、酶解、超高壓-限制性酶解工藝制備的豆乳粉，其溶解性及蛋白質(zhì)消化率均顯著增加（P＜0.05），過敏原含量顯著減少（P＜0.05），且與單獨超高壓處理制備的豆乳粉相比，單獨酶解制備的豆乳粉蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少，但蛋白質(zhì)分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）。超高壓-限制性酶解制備工藝得到的蛋白質(zhì)分散指數(shù)及蛋白質(zhì)消化率最高，可分別高達84.2%及81.65%，過敏原含量最少，為1.20 mg/g，且與單獨超高壓和酶解處理相比，超高壓-限制性酶解制備的豆乳粉，其蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少，進一步證明超高壓與限制性酶解的協(xié)同作用，可一定程度上改善豆乳粉的營養(yǎng)性及安全性。原因可能是超高壓處理導(dǎo)致大豆蛋白結(jié)構(gòu)變化，柔性增加，提高蛋白的界面吸附能力，乳化性增強，對豆乳中的油脂有更高的包裹效率，繼而提高豆乳粉的溶解性及蛋白質(zhì)消化率；酶解處理導(dǎo)致蛋白大分子降解為小分子多肽，疏水基團、極性基團暴露，蛋白的表面電荷分布加強，乳化能力提高，從而豆乳粉溶解性增大，酶解物小分子肽更易被人體消化吸收，繼而提高豆乳粉的蛋白質(zhì)消化率[26-28]。

2.5 不同工藝豆乳粉分子質(zhì)量分布的對比分析

圖8 不同豆乳粉乳液的SDS-PAGE圖Fig. 8 Protein electrophoresis patterns of different soybean milk emulsions

由圖8可知，傳統(tǒng)濕法工藝制備的豆乳粉主要致敏蛋白為β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白，Gly m Bd 30 kDa（P34）和GIy m Bd 28 kDa含量較少。經(jīng)超高壓制備的豆乳粉與傳統(tǒng)濕法工藝相比，SDS-PAGE圖譜變化不大，說明超高壓處理降低致敏性的原理主要是改變豆乳蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗原表位埋藏于蛋白內(nèi)部，或者在乳化過程中，蛋白在水包油界面發(fā)生復(fù)雜性變化，可能與大豆磷脂結(jié)合，使抗原表位失活。經(jīng)限制性酶解工藝制備的豆乳粉β-伴大豆球蛋白已完全降解，但還有少量的大豆球蛋白G2堿性鏈，說明風(fēng)味蛋白酶對β-伴大豆球蛋白的降解效果更好，分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽增多，說明限制性酶解降低豆乳粉致敏性的作用機理主要是對致敏蛋白的降解作用，進一步證明限制性酶解對降低豆乳粉致敏性的積極影響[3]；經(jīng)超高壓-限制性酶解工藝得到的豆乳粉，β-伴大豆球蛋白已完全降解，與單獨酶解制備的豆乳粉電泳條帶相比，大豆球蛋白G2堿性鏈及分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽所對應(yīng)條帶顏色較淺，小分子肽進一步降解為游離氨基酸，進一步說明超高壓與限制性酶解對降低致敏性的協(xié)同效應(yīng)[29-30]。

3 結(jié) 論

本實驗對超高壓-限制性酶解制備低致敏性豆乳粉工藝進行研究，單因素試驗表明超高壓處理壓強、超高壓處理時間、超高壓處理溫度、酶解時間及酶添加量對豆乳粉中抗敏原含量均有顯著影響。由響應(yīng)面分析結(jié)果可知，超高壓-限制性酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為超高壓處理壓強320.00 MPa、超高壓處理時間15 min、酶解時間60 min、酶添加量0.3 U/g，此條件下致敏性降低率為88.09%，但制備的豆乳粉具有微苦味，需進行豆乳粉-木糖醇質(zhì)量比為1∶3的調(diào)配后遮蔽苦味。且分別采用離心法、體外模擬胃腸道消化及夾心式酶聯(lián)免疫法對比不同工藝制備豆乳粉的溶解性、蛋白質(zhì)消化率及過敏原含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)濕法工藝相比，經(jīng)超高壓、酶解、超高壓-限制性酶解工藝制備的豆乳粉，其溶解性及蛋白質(zhì)消化率均顯著增加（P＜0.05），過敏原含量顯著減少（P＜0.05），且超高壓與限制性酶解具有協(xié)同作用，與單獨超高壓和酶解處理相比，該工藝制備豆乳粉的蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少。由SDS-PAGE分析可知傳統(tǒng)濕法工藝制備豆乳粉主要致敏蛋白為β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白；經(jīng)超高壓制備的豆乳粉與傳統(tǒng)濕法工藝相比，SDS-PAGE圖譜變化不大；限制性酶解處理可完全降解豆乳粉的β-伴大豆球蛋白，保留少量大豆球蛋白G2堿性鏈；經(jīng)超高壓-限制性酶解工藝得到的豆乳粉，β-伴大豆球蛋白已完全降解，部分大豆球蛋白G2堿性鏈及分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽進一步降解為游離氨基酸，進一步說明超高壓與限制性酶解對降低致敏性的協(xié)同效應(yīng)。