感染草魚呼腸孤病毒對腸道菌群多樣性的影響

朱文根 李星浩 饒劉瑜 黃 潔 余育和 肖凡書 顏慶云

(1. 中國科學院水生生物研究所中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京100049; 3. 中山大學環(huán)境科學與工程學院, 環(huán)境微生物組學研究中心, 廣州 510006)

動物腸道內(nèi)生活著大量的微生物, 包括真核微生物、細菌、古菌和病毒等[1]。在腸道微生態(tài)系統(tǒng)中, 各種微生物與宿主經(jīng)過長期的協(xié)同進化, 在調(diào)節(jié)宿主生理生化反應、促進消化吸收、介導宿主免疫應答和抵制宿主疾病發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的作用, 以至于被認為是動物額外的器官[2—5]。這些與腸道聯(lián)系緊密的共生菌群, 與宿主相互作用,共同維系整個腸道生態(tài)系統(tǒng)平衡與穩(wěn)定。然而, 腸道正常菌群不是一成不變的, 可因環(huán)境、餌料、宿主行為和基因型等的不同有所差異, 但總體上處于相對穩(wěn)定狀態(tài)[6—9]。

有研究表明, 有些腸道微生物只是隨機進入腸道或暫時生活于此, 而某些病原微生物入侵腸道微環(huán)境, 可直接或間接影響腸道正常菌群的平衡與穩(wěn)定[10]。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn), 患有癤病的圓口銅魚腸道菌群多樣性顯著低于健康圓口銅魚, 且腸道菌群在患病個體間的差異也遠大于健康個體間差異。對患有“紅鰓病”的鯽與健康鯽腸道菌群進行對比分析, 也得出相似的結(jié)論[12], 這表明病原入侵會導致腸道菌群發(fā)生紊亂。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國最為重要的淡水養(yǎng)殖魚類, 在長江、珠江流域養(yǎng)殖量極大[13]。草魚幼苗容易感染病原發(fā)病, 其中威脅最大的是草魚出血病(Grass carp hemorrhage)。草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是草魚出血病的主要病原, 其致病類型主要有3種: “紅肌肉型”、“紅鰭紅鰓蓋型”、“腸炎型”[14]。其中, 患腸炎型(由GCRV感染草魚引起的腸道炎癥)出血病會導致草魚腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生劇烈變化[15]。目前有關(guān)草魚腸道菌群的研究多局限于從成年草魚消化道內(nèi)分離培養(yǎng)與纖維素水解相關(guān)的微生物, 研究不同餌料飼喂下草魚消化道微生物的群落結(jié)構(gòu), 以及影響草魚消化道微生物群落結(jié)構(gòu)的因素等[9,16—18], 關(guān)于GCRV感染對草魚腸道菌群的影響研究還鮮見報道。對此, 本研究運用高通量測序技術(shù), 對健康草魚和人工感染GCRV草魚腸道菌群進行了比較研究, 以期為該病的防治提供腸道微生物方面的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與樣品采集

實驗草魚(體重20—30 g/尾)來自于中國科學院水生生物研究所官橋養(yǎng)殖基地, 采樣前1周轉(zhuǎn)移至中國科學院水生生物研究所室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng), 水溫控制在24—28℃, 期間投喂人工配合飼料。室內(nèi)馴化1周后選規(guī)格相同的草魚隨機分成病毒感染組和對照組。病毒感染組草魚通過浸泡在GCRV水溶液中10min, 對照組草魚則浸泡在不含GCRV的水溶液中10min作對照處理。分別于感染GCRV后第2、第4、第6天(從處理組開始有草魚表現(xiàn)出不適到因感染病毒導致死亡過程)分別隨機各取3尾感染組和對照組草魚進行后續(xù)分析。在第6天實驗組增加3尾死亡草魚樣品的分析(因此對照組共9尾,感染病毒處理組12尾)。由于草魚個體較小, 腸道樣品取整個腸道用來提取菌群DNA, 樣品的具體采集和處理方法參照文獻[19]進行。

1.2 草魚腸道菌群16S rRNA基因高通量測序分析

草魚腸道菌群DNA采用MoBio PowerFecal試劑盒參照說明書提取, 基因組DNA保存在-20℃; 首先, 用NanoDrop檢測DNA樣品的濃度, 將所有DNA樣品濃度稀釋到2 ng/μL用于PCR擴增。16S rRNA基因PCR擴增參照Wu等[20], 步驟如下: 25 μL反應體系中包含1×Buffer II, 正、反向引物(515F、806R)各0.8 μmol/L, 0.5U的AccuPrimeTMTaq酶和10 ng模板DNA序列, 每個樣品平行做3個重復, 并設(shè)陰性對照; PCR擴增程序如下: 94℃ 1min, 后接10個循環(huán)(94℃ 20s, 53℃ 25s, 68℃ 45s)之后68℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Agencourt Ampure XP純化后再次作為模板進行第二次PCR擴增, 擴增條件和第一輪PCR一致, 但是所使用的反向引物加了barcode標記, 并進行20個循環(huán), 此兩步法PCR能很好地降低barcode引物的擴增偏好性[20]。最后, PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠進行檢測。在所有樣品都成功擴增后,各樣品PCR產(chǎn)物用PicoGreen (Molecular Probes)進行定量。300 ng樣品的PCR產(chǎn)物等量混合, 并用瓊脂糖凝膠在90 V下電泳2h, 目的片段使用DNA純化試劑盒(Qiagen)純化后再次進行PicoGreen定量, 建庫后使用MiSeq測序平臺進行測序。所得到DNA序列分析參照Wu等[20]的方法進行分析, 并通過RDP (Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫進行比對和OTU分類。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分析過程使用R語言環(huán)境和PAST 2.0軟件, 其中, R語言使用了vegan、VennDiagram、ggplot 2和ggfority程序包。進行的分析主要包括: (A)每個腸道樣品做OTU稀釋性曲線; (B)計算每個樣品的Alpha多樣性, 參數(shù)包括: 香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Wienner index)、辛普森指數(shù)(Inverse Simpson index)、皮魯均勻度指數(shù)(Pielou evenness index)、辛普森均勻度指數(shù)(Simpson evenness index); (C)計算了Beta多樣性, 包括非參數(shù)檢驗: 基于Bray-Curits距離的MRPP(Multiple-Response Permutation Procedure)、Anosim (Analysis of Similarity)、Adonis分析。同時也進行了主成分分析(Principal component analysis, PCA); (D)通過維恩圖(Venn diagram)統(tǒng)計兩組樣品共有(shared)和特有(Unique)OTU; (E)用SPSS 24.0對實驗組和對照組Alpha多樣性指數(shù)進行獨立樣本t檢驗(Independent samplest-test)、對腸道菌群在處理組和對照組組內(nèi)兩兩個體間距離均值進行威爾科克森檢驗(Wilcoxon test)以及對兩組樣品腸道優(yōu)勢OTU (relative abundance＞1%)進行t檢驗(t-test)。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析結(jié)果表明, 除辛普森均勻度指數(shù)外, 感染組的香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、皮魯均勻度指數(shù)均顯著低于對照組(t-test,P＜0.05), 表明GCRV感染使草魚腸道菌群的物種多樣性和均勻度明顯降低(圖 1)。對每個樣品進行OTU稀釋性曲線的分析中, 也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律, 感染組樣品OTU數(shù)普遍低于對照組(圖 2)。

2.2 腸道菌群Beta多樣性分析

圖 3顯示對照組草魚腸道內(nèi)總共有646個OTUs,而病毒處理組則檢測到了498個OTUs, 相比對照組減少了148個OTUs。此外, 對照組中特有的OTUs為394個, 而GCRV感染后草魚特有OTUs為246個;2組草魚共有OTUs數(shù)為252個。

對所有樣品進行基于Bray-Curits距離的差異分析(表 1), 結(jié)果表明GCRV感染組草魚和對照組草魚腸道菌群差異顯著(MRPP, Anosim, Adonis,P＜0.01)。

圖 1 處理組(右邊)和對照組(左邊)草魚腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較Fig. 1 Comparing alpha-diversity index between treated (right)and control (left) groups

對所有草魚樣品腸道菌群進行PCA排序(圖 4A),對照組各樣點聚集較為緊密, 說明腸道菌群在個體之間的差異較小。處理組草魚各樣點相距較遠, 說明腸道菌群在個體之間的差異較大。此外, 第一軸(PC1)的解釋變異量為63.73%, 第二軸(PC2)的解釋變異量為21.67%, 2個軸解釋變異量累計高達85.4%。對處理組和對照組腸道菌群在組內(nèi)個體間Bray-Curtis距離進行比較, 發(fā)現(xiàn)腸道菌群在病毒感染組不同個體間的平均距離要顯著高于對照組草魚(Wilcoxon test,P＜0.05, 圖 4B)。

2.3 腸道菌群組成

在門水平進行分析比較發(fā)現(xiàn)(圖 5), 對照組樣品中共檢測到18個菌門, 分別為脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、泉古菌門(Crenarchaeota)、衣原體門(Chlamydiae)、柔膜菌門(Tenericutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍藻門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和其他未被分類的細菌。而實驗組樣品中則總共檢測到15個菌門, 與對照組相比少了脫鐵桿菌門、芽單胞菌門、裝甲菌門、泉古菌門, 但新增了棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。在所有的菌門中, 處理組與對照組共有優(yōu)勢菌門為變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門, 4個優(yōu)勢菌門在GCRV感染組和對照組草魚腸道菌群中所占得比例分別為98.3%和97.4%。

將相對豐度大于1%的OTU進行比較發(fā)現(xiàn), 對照組草魚樣品優(yōu)勢OTUs有17個, 而GCRV感染的草魚樣品優(yōu)勢OTUs有10個(表 2)。處理組草魚腸道內(nèi)OTU_504 (Comamonadaceae, 叢毛單胞菌科)、OTU_69 (Pasteurellaceae, 巴斯德氏菌科)、OTU_1898 (Cetobacteriu, 鯨桿菌屬)和OTU_822 (Uliginosibacterium)相對豐度顯著低于對照組(t-test,P＜0.05)。OTU_504 (叢毛單胞菌科)在健康草魚體內(nèi)相對豐度為5.4%, 而在處理組草魚腸道內(nèi)則僅為1.5%。OTU_1898 (鯨桿菌屬)和OTU_1357 (Gammaproteobacteria, γ變形菌綱)在對照組草魚腸道樣品的相對豐度分別為3.5%和10.5%, 而在處理組則下降為1.1%和8.8%。其他OTU感染GCRV后也有不同程度的下降, OTU_66 (Neisseriacea, 奈瑟氏球菌科)、OTU_98 (Shewanella, 希瓦氏菌屬)、OTU_163(Chitinophagaceae)、OTU_471 (Clostridiales, 梭菌目)和OTU_94 (Neisseriacea, 奈瑟氏球菌科)等在病毒處理組相對豐度降至1%以下。然而, 也有部分OTU相對豐度在感染GCRV后反而增加了, 其中增加幅度最為明顯的是OTU_434 (Cetobacteriu, 鯨桿菌屬), 該OTU的相對豐度在感染病毒的草魚腸道內(nèi)急劇上升, 由29.3%上升至46%。同樣, OTU_1154(Vibrionaceae, 弧菌科)上升幅度較大, 由1.5%增至12.3%。此外, 處理組中新增加一優(yōu)勢OTU, 即OTU_48 (Vibrio, 弧菌屬)。OTU_893 (Aeromonas,氣單胞菌屬)在兩組腸道樣品中相對豐度差別不大。

圖 2 處理組和對照組樣品物種豐度的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves between treated and control groups based on sequencing results

圖 3 處理組和對照組OTU數(shù)量對比維恩圖Fig. 3 Venn diagram representing shared OTUs between treated and control groups

表 1 基于Bray-Curits距離的差異顯著性檢驗Tab. 1 Comparing the results of dissimilarity test between the treated and control groups based on Bray-Curtis dissimilarity

3 討論

魚類腸道內(nèi)定植著種類豐富、數(shù)量龐大的菌群[21,22]。在正常情況下, 腸道菌群之間、菌群與宿主之間處于動態(tài)平衡, 從而維持著魚類腸道正常生理功能[5]。但當受到病原微生物感染時, 腸道菌群的平衡狀態(tài)受到干擾后可能被打破[11,12]。腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡可能使得宿主的免疫系統(tǒng)受到影響, 某些條件致病菌還有可能會轉(zhuǎn)移或危及宿主其他組織器官, 導致細菌性疾病爆發(fā)[23,24]。因此, 腸道微生態(tài)的相對穩(wěn)定對于宿主的健康有著重要的意義。

圖 4 PCA排序圖(A)及處理組和對照組(B)組內(nèi)個體間距離差異比較Fig. 4 Comparing beta-diversity index between the GCRV-infected and healthy grass carps A. The treated and control samples were visualized by PCA. B. Comparing Bray-Curtis dissimilarities between individuals in the GCRV-infected and control groups

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總量的近70%[25],其中草魚是我國最重要的淡水養(yǎng)殖魚類。在草魚養(yǎng)殖常見的疾病中, 草魚呼腸孤病毒導致的出血病常常給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。感染該病毒的草魚, 其腸腔內(nèi)黏液減少, 上皮細胞大量壞死脫落[15], 腸道微生態(tài)環(huán)境的急劇惡化, 因此腸道菌群很有可能失去原有的平衡狀態(tài)而變得紊亂。雖然以往的研究表明病原感染可引起水生動物腸道群菌紊亂[11,26], 但GCRV感染對草魚腸道菌群的影響尚不清楚。

圖 5 實驗組與對照組腸道微生物在門水平相對豐度比較Fig. 5 Relative abundance of the phyla in the treated and control groups

表 2 相對豐度大于1%的OTU對比分析Tab. 2 OTU with relative abundance greater than 1% in treated and control groups

本研究利用MiSeq高通量測序研究了GCRV感染對草魚腸道菌群的影響, 結(jié)果表明GCRV感染使得草魚腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化(MRPP, Anosim, Adonis,P＜0.01), 李東亮等[27]用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染草魚得到類似的結(jié)果。腸道作為一個小型生態(tài)系統(tǒng), 眾多的微生物棲息于此并形成復雜的生態(tài)群落[28]。腸道正常菌群及腸道生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與腸道功能密切相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn), GCRV感染組草魚腸道菌群Alpha多樣性顯著低于對照組草魚(Independent samplest-test,P＜0.05), 說明腸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了紊亂。在正常情況下, 腸道正常菌群牢固地附著于腸黏膜和腸上皮細胞表面。但感染GCRV后, 其腸腔內(nèi)黏液減少、上皮細胞成片脫落[15], 正常菌群因失去附著位點而極易隨排泄物排出體外。此外, 發(fā)生腸炎的草魚攝食減弱, 導致腸道正常菌群賴以生存的資源減少, 也可能是部分腸道正常菌群數(shù)量減少的原因之一[30]。

已有基于DGGE[19]、純培養(yǎng)[16]和高通量測序[31,32]的結(jié)果表明, Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria為草魚腸道的主要類群, 本研究結(jié)果與之相符。然而與健康草魚相比, 感染GCRV的草魚腸道內(nèi)Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes相對豐度均有不同程度的下降, 而Fusobacteria則有較大幅度增加。其他非優(yōu)勢菌門如Deferribacteres、Gemmatimonadetes、Armatimonadetes、Crenarchaeota在病毒感染組中消失。這些變化, 一方面, 可能與患病草魚攝食減少導致腸道中可利用的資源減少有關(guān)[33]。另一方面, 可能與感染病毒后腸道微生態(tài)環(huán)境惡化存在關(guān)聯(lián)[15]。此外,有研究表明免疫系統(tǒng)對腸道菌群有著重要的影響[34,35]。而GCRV對草魚免疫系統(tǒng)有著重要的影響[36], 因此, GCRV病毒也有可能通過干擾草魚免疫系統(tǒng)間接影響腸道菌群組成, 但還有待進一步證實。

研究表明感染GCRV的草魚腸上皮細胞會大量脫落[15], OTU_434相對豐度在感染組明顯升高,該OTU在Cetobacteriu豐度占比極高(96%) , 可能與Cetobacteriu能合成的維生素B12 (Vitamin B12)促進腸道細胞修復有關(guān)[36,37]。感染GCRV后OTU_98(Shewanella)在腸道中相對豐度有所下降。有研究表明饑餓能夠改變腸道菌群[38,39]。在本實驗中,Shewanella(OTU_98)相對豐度降低可能與患病草魚攝食減少, 腸道營養(yǎng)貧乏有關(guān)[40]。

綜上所述, GCRV感染會導致草魚腸道正常菌群紊亂。腸道菌群發(fā)生紊亂往往伴隨著致病菌過度增殖, 引起腸道微生態(tài)失衡和機體的炎癥反應,導致疾病的發(fā)生或病情的加重[41]。健康宿主腸道微生物可通過與致病菌競爭黏附位點、介導調(diào)節(jié)腸道免疫應答等方式抑制病原菌的增殖, 來緩解或防止腸道炎癥[5]。因此, 如果能從草魚腸道內(nèi)分離出這些有益微生物并制成微生態(tài)制劑投喂草魚, 或許能使已發(fā)生紊亂的腸道菌群恢復至正常狀態(tài), 從而為緩解或防止草魚出血病提供幫助。本研究從草魚腸道菌群入手, 能為草魚病毒性出血病的防治和深化研究提供依據(jù)和參考。