氧化油脂對斑點叉尾鮰生長、體色和抗氧化能力的影響

梁高楊 李小勤 高啟平 還殿宇 楊 航 徐 禛 冷向軍

(1. 上海海洋大學, 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學, 農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心,上海 201306; 3. 上海海洋大學, 水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心, 上海 201306; 4. 通威集團股份有限公司, 成都610041)

魚油因富含魚類生長所需必需脂肪酸, 促進生長, 有利于脂質代謝[1], 在水產(chǎn)飼料中廣泛添加。然而, 其又極易受到環(huán)境溫度、光照和水分的影響發(fā)生氧化酸敗, 產(chǎn)生一系列過氧化物和不飽和醛酮等有毒有害物質[2], 造成養(yǎng)殖品類生長速度下降[3,4]、體色異常[5]和組織病變[6,7]。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)攝食2%氧化魚油后, 增重率下降、飼料系數(shù)升高[4]; 在大口黑鱸(Micropterus salmoides)攝食9%氧化魚油后, 骨骼畸形、肝臟和肌肉維生素E含量降低, MDA含量增加[8]。然而, 現(xiàn)有研究主要集中在魚油氧化對水產(chǎn)動物的危害, 而關于豆油和混合油脂氧化對水產(chǎn)動物的影響卻罕見報道。

近年來, 魚油資源緊缺、價格上漲, 尋求其他脂肪源部分或完全替代魚油, 已十分緊迫。植物油尤其是豆油來源廣、資源豐富、價格低, 富含亞油酸, 亞麻酸, 是水產(chǎn)飼料中一種良好的脂肪源。目前在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[9]、羅非魚(Oreochromis niloticus)[10]、施氏鱘(Acipenser schrenckii)[11]、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[12]和框鱗鏡鯉(Cyprinus carpiovar.specularis)[13]上的研究發(fā)現(xiàn), 使用豆油部分或完全替代魚油, 其生長效果等同或略好于魚油。然而, 在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)上, 不同脂肪源對其生長影響的研究報道很少。

本試驗以斑點叉尾鮰為研究對象, 在飼料中分別以豆油代替0(魚油組)、50%(混合油脂組)和100%魚油(豆油組), 另將該3種油脂氧化后添加于飼料, 考察豆油代替魚油的作用效果, 及氧化油脂對斑點叉尾鮰生長性能、體色和肝臟抗氧化能力的影響, 為水產(chǎn)飼料中油脂的合理使用和預防氧化油脂的危害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 魚油、豆油的氧化制備

魚油購自蘇州通威飼料股份有限公司, 豆油以壓榨法由當?shù)卣ビ蛷S生產(chǎn)。魚油和豆油的氧化參考Chen等[8]的方法加以改進。具體方法: 于60℃水浴環(huán)境下, 在新鮮魚油和新鮮豆油中間歇性通入空氣, 每通入10min空氣后暫停30min, 24h測定1次魚油和豆油的過氧化值(Peroxide value, POV), 當POV達到350 meq/kg時停止通入空氣, -20℃冰箱保存, 待用。

過氧化值(POV)、酸價(Acid value, AV)的測定參考AOCS的標準方法[14,15], 羰基價(Carbonyl value,CV)測定參考Endo等[16]的方法, 具體值見表 1。

1.2 試驗飼料

以魚粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕(粗蛋白質含量分別為66.8%、45.5%、36.6%和45.5%)為主要蛋白源, 配制6組等蛋等脂肪飼料, 分別為6%魚油組(FO-6, 魚油對照組)、6%豆油組(SO-6, 豆油對照組)、3%魚油+3%豆油組(MO-6, 混合油脂對照組),6%氧化魚油組(OFO-6)、6%氧化豆油組(OSO-6)、3%氧化魚油+3%氧化豆油組(OMO-6), 飼料組成及營養(yǎng)水平見表 2。飼料原料經(jīng)粉碎后過40目篩, 逐級混合, 用SLP-45型單螺桿擠壓機(中國水產(chǎn)科學研究院漁業(yè)機械研究所)制成直徑2.5 mm的顆粒飼料, 制粒溫度為(85±5)℃, 55℃烘干, 4℃保存, 待用。

1.3 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

斑點叉尾鮰購于安徽巢湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場, 于試驗開始前用試驗飼料(FO-6∶SO-6=1∶1)馴養(yǎng)1周。選取252尾平均體重為(150.5±4.2) g的斑點叉尾鮰, 隨機分為6組, 每組3個重復, 每個重復14尾魚, 隨機分配到18口網(wǎng)箱(1.5 m×1.0 m×1.2 m)中, 每6口網(wǎng)箱置于一口室內水泥池(5.0 m×3.0 m×1.2 m)內, 共3口水泥池。日投喂2次(09:00、17:00), 投飼量約為體重的3%, 每周根據(jù)投飼量估算魚體重并調整投飼量,確保在投飼后10min內無殘餌。在試驗期間, 每周換水2次, 每次換水1/3, 水源為過濾后的池塘水, 水溫 (26±2)℃, pH 7.5±0.5, 溶氧＞6.0 mg/L, 氨氮＜0.2 mg/L。養(yǎng)殖試驗在上海海洋大學濱海室內養(yǎng)殖場進行, 養(yǎng)殖試驗為8周。

表 1 魚油、豆油的氧化指標Tab. 1 Oxidative indexes of fish oil and soybean oil

表 2 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎, %)Tab. 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis, %)

1.4 樣品采集及分析

生長和形體指標計算養(yǎng)殖試驗結束后, 禁食24h, 記錄試驗魚尾數(shù)并稱重, 用于計算增重率(WGR)、飼料系數(shù)(FCR)和存活率(SR); 每網(wǎng)箱隨機取3尾魚, 測量體長、體重, 于冰上解剖后稱量其內臟重、肝臟重用于計算肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和肥滿度(CF)。

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100×[終末體重(g)-初始體重(g)]/初始體重(g)

飼料系數(shù)(Feed conversion ratio,FCR)=總攝食量(g)/[終末體重(g)-初始體重(g)]

存活率(Survival rate,SR, %)=100×終末魚總數(shù)(尾)/初始魚總數(shù)(尾)

肝體指數(shù)(Hepatosomatic index,HSI, %)=100×肝臟重(g)/體重(g)

臟體指數(shù)(Viscerosomatic index,VSI, %)=100×內臟重(g)/體重(g)

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×體重(g)/體長(cm)3

皮膚和肌肉色度值(L*、a*、b*)的測定每口網(wǎng)箱另取3尾魚, 用吸水紙吸干魚體表面水分, 用色差計(WSC-C, 上海精密科學儀器有限公司)測定魚體同一側背部(背鰭下方)、尾部(脂鰭下方)、腹部(胸鰭與腹鰭之間)三處的色度值(L*、a*、b*),剝除皮膚后, 測定背肌前部和后部2處的色度值(L*、a*、b*), 其中L*(±)代表亮度值, a*(±)代表紅綠值, b*(±)代表黃藍值。白板的初始值為L*(93.7±0.8)、a* (0.0±0.1)、b* (4.2±0.3)。

飼料及肌肉常規(guī)成分分析測定肌肉色度值后, 取背鰭下側線上的雙側背部肌肉, -20℃保存,用于常規(guī)成分分析。飼料和肌肉水分含量采用105℃烘干干燥法測定; 粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定(Kjeltec2300, 福斯, 瑞典); 粗脂肪含量采用索氏抽提法測定(SOX600, 北京托摩根生物科技有限公司); 灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法測定。

血清生化指標及肝臟抗氧化指標分析每口網(wǎng)箱隨機取魚3尾, 尾靜脈取血, 4℃離心(3000 r/min, 10min), 取血清分裝, -80℃保存, 用于測定總膽紅素(Total bilirubin, TBil)、直接膽紅素(Direct bilirubin, DBil)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)。

將取血后的斑點叉尾鮰解剖后取一定質量肝臟樣品, 生理鹽水沖洗表面血液, 加9倍體積0.86%的生理鹽水, 冰水浴勻漿, 4℃離心(3000 r/min,10min), 取上清液分裝后于-20℃保存, 用于測定肝臟還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malonaldehyde, MDA)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)。

血清TBil、DBil、ALT、AST和肝臟SOD、GSH分別采用化學氧化法、化學氧化法、賴氏法、賴氏法、水溶性四氮唑法(Water Soluble Tetrazolium, WST法)和5, 5′-二硫代-雙(硝基苯甲酸)法(3-Carboxy-4-nitrophenyl disulfide, DTNB法)測定,6種指標的測定均利用酶標儀(Synergy 2, 伯騰, 美國)完成。MDA和CAT分別采用2-硫代巴比妥酸法(2-Thiobarbituric acid, TBA法)和鉬酸銨法測定, 測定儀器為可見分光光度計(722型, 上海精密科學儀器有限公司)。肝臟蛋白質含量采用聚氰基丙烯酸正丁酯法(Butyleyanoacrylate, BCA法)測定。所需試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供, 所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用SPSS22.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA), 用Duncan氏法進行組間差異分析,P＜0.05表示差異。

2 結果

2.1 生長和形體指標

由表 3可知, 斑點叉尾鮰攝食6%魚油、6%豆油和6%混合油脂飼料后, 在增重率、飼料系數(shù)和形體指標上無顯著差異 (P＞0.05); 與魚油、豆油、混合油脂組相比, 氧化魚油、氧化豆油、氧化混合油脂組的增重率分別降低14.9%、10.8%和13.2%(P＜0.05), 飼料系數(shù)升高19.6%、14.9%和18.8%(P＜0.05), 成活率降低4.8%、4.8%和2.4% (P＞0.05);氧化魚油組臟體比顯著低于6%魚油組(P＜0.05), 其他組肝體比、臟體比、肥滿度無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 肌肉常規(guī)成分

由表 4可知, 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后,肌肉粗脂肪含量降低(P＜0.05); 各處理組在肌肉水分、粗蛋白質、灰分含量上無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 皮膚和肌肉色度值(L*、a*、b*)

由表 5可知, 魚油、豆油和混合油脂組的皮膚和肌肉色度值無顯著差異(P＞0.05); 斑點叉尾鮰攝食三組氧化油脂飼料后, 背部和尾部皮膚b*增加(P＜0.05), 腹部皮膚和背部肌肉(前端、后端)色度值(L*、a*、b*)均無顯著變化(P＞0.05)。

2.4 血清生化指標

由表 6可知, 魚油、豆油和混合油脂組的血清生化指標無顯著差異(P＞0.05); 斑點叉尾鮰攝食三組氧化油脂飼料后, 血清ALT、AST、TBIL和DBIL均顯著增加(P＜0.05), 其中氧化魚油組的AST活性顯著高于氧化豆油和氧化混合油脂組(P＜0.05)。

2.5 肝臟抗氧化指標

由表 7可知, 魚油、豆油和混合油脂組的肝臟抗氧化指標無顯著差異(P＞0.05); 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后, 肝臟SOD、CAT和GSH降低(P＜0.05), MDA升高(P＜0.05), 其中氧化魚油組CAT顯著低于氧化豆油和氧化混合油脂組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 魚油、豆油對斑點叉尾鮰作用效果的比較

魚油含有大量長鏈不飽和脂肪酸, 能滿足魚類對必需脂肪酸。用豆油完全替代飼料中的魚油, 團頭魴(Megalobrama amblycephala)[17]和大西洋白姑魚(Argyrosomus regius)[18]特定生長率分別降低22.7%和19.1%, 飼料系數(shù)增加17.6%和42.5%; 然而在吉富羅非魚[10]、施氏鱘[11]和瓦式黃顙魚[12]飼料中魚油被豆油完全替代后, 對生長性能無顯著負面影響。可見, 以豆油取代魚油的效果, 因魚的種類、油脂氧化程度和飼料保存條件而呈現(xiàn)很大差異。本試驗以豆油代替50%(混合油脂組)和100%魚油(豆油組)后, 對斑點叉尾鮰生長性能、飼料利用、肌肉組成、體色、肝功能和抗氧化能力均無顯著影響。飼料中添加油脂主要是為了滿足魚類對能量和必需脂肪酸的需求, 在同等水平添加條件下, 不同油脂的作用效果差異主要體現(xiàn)在不飽和脂肪酸的含量和比例方面。斑點叉尾鮰屬于淡水性魚類, 其對脂肪酸的需求主要是C18系列高不飽和脂肪酸[19], 豆油以及混合油脂(魚油、豆油等比例混合)因富含C18系列高不飽和脂肪酸, 可以滿足斑點叉尾鮰對必需脂肪酸的需求。因此, 在斑點叉尾鮰飼料中, 可以用豆油替代魚油, 不會造成生長性能的下降。

3.2 油脂氧化對斑點叉尾鮰生長性能的影響

Chen等[8]以含9%不同氧化程度的氧化魚油飼料飼喂大口黑鱸幼魚, 促進了魚體攝食, 提高了魚體增重率; 長吻 (Leiocassis longirostrisGünther)攝食不同含量的氧化魚油飼料, 增重率和飼料系數(shù)無顯著變化[5]。然而大多數(shù)的研究表明, 魚類攝食氧化油脂飼料后, 會導致生長性能下降。奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O. aureus)攝食4%氧化混合油脂(魚油∶豆油=1∶1)20d后, 增重率顯著降低, 飼料系數(shù)顯著升高[20]; 花鱸(Lateolabrax japonicus)攝食10%氧化魚油, 增重率、特定生長率顯著降低[21];在黃顙魚飼料添加2%氧化魚油, 增重率、蛋白質沉積效率均顯著降低[4]。在本次試驗中, 斑點叉尾鮰攝食3種氧化油脂飼料后, 均導致增重率降低, 飼料系數(shù)升高(表 3)。飼料中氧化油脂的數(shù)量和油脂氧化程度是造成上述不同結果的主要原因。油脂氧化的主要產(chǎn)物包括自由基等初級氧化產(chǎn)物和醛、酮等次級氧化產(chǎn)物, 能夠消耗飼料中的還原性維生素, 降低飼料中不飽和脂肪酸含量[22,23], 造成飼料營養(yǎng)價值降低, 難以滿足魚類的生長需求; 氧化油脂中的醛類物質還可造成魚類腸道發(fā)炎, 黏膜受損[24,25], 降低了營養(yǎng)物質的消化率[6], 導致生長性能下降。此外, 不同魚種、不同生長階段對氧化油脂的耐受性不同, 這也可能是造成不同研究結果的原因。

表 3 氧化油脂對斑點叉尾鮰生長和形體指標的影響Tab. 3 Effects of oxidized oils on growth and morphological indexes of channel catfish

表 4 氧化油脂對斑點叉尾鮰肌肉常規(guī)成分的影響(鮮重, %)Tab. 4 Effects of oxidized oils on muscle conventional components of channel catfish (wet weight basis, %)

表 5 氧化油脂對斑點叉尾鮰皮膚和肌肉色度值(L*、a*、b*)的影響Tab. 5 Effects of oxidized oils on chroma values of skin and muscle of channel catfish

表 6 氧化油脂對斑點叉尾鮰血清生化指標的影響Tab. 6 Effects of oxidized oils on serum biochemical indexes of channel catfish

表 7 氧化油脂對斑點叉尾鮰肝臟抗氧化指標的影響Tab. 7 Effects of oxidized oils on liver antioxidant indexes of channel catfish

3.3 氧化油脂對斑點叉尾鮰肌肉常規(guī)成分的影響

在黃顙魚攝食氧化魚油飼料后, 全魚粗脂肪含量顯著降低[4], 斑點叉尾鮰幼魚攝食氧化魚油飼料,全魚粗脂肪和粗蛋白質含量均顯著下降[6], 草魚(Ctenopharyngodon idellus)攝食氧化魚油飼料, 其全魚和背肌粗脂肪和粗蛋白質含量均顯著降低[26]。在本次試驗中, 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后,背肌粗脂肪含量顯著降低, 而粗蛋白質和灰分含量在數(shù)值上有升高, 但無顯著差異(表 4)。魚類攝食氧化油脂后肝組織損傷, 肝功能下降[6,8], 本試驗血清轉氨酶和膽紅素較非氧化油脂組顯著升高(表 6),也說明肝臟可能受到氧化油脂的破壞。肝臟是脂肪代謝中樞, 受損后不能正常合成、轉運脂肪, 魚體內的脂肪做為能量消耗后的得不到有效補充, 從而含量降低。

3.4 氧化油脂對斑點叉尾鮰肝臟抗氧化功能和體色的影響

膽紅素(TBIL)由間接膽紅素(Indirect bilirubin,IBIL)和直接膽紅素(DBIL)組成, IBIL是血紅細胞降解產(chǎn)物, 經(jīng)由肝臟轉化成DBIL后排出體外[27]。在哺乳動物和人類中, 血液中高膽紅素會引起皮膚、肌肉和鞏膜等組織黃染[28], 血清膽紅素和轉氨酶升高是臨床上判斷肝細胞性黃疸的直接依據(jù)[29]。在本試驗中, 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后, 血清DBIL、TBIL、ALT和AST均增加(表 6), 表明膽紅素不能正常經(jīng)由肝臟排出體外, 在血液中產(chǎn)生積累。血清膽紅素增加可能是斑點叉尾鮰皮膚b*值(黃度值)升高的一個原因, 另一個可能的原因是氧化油脂影響了黑色素的形成, 使得皮膚黃度得以表現(xiàn), 這有待于在今后的研究中通過測定黑色素含量和酪氨酸酶活性而加以證實。然而, 肌肉色度值并沒有顯著差異, 可能是膽紅素沉積具有組織特異性,也可能與沉積時間不足有關。

肝臟作為機體脂肪代謝和解毒中樞, 由非酶系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)共同清除體內自由基, 保護機體免受氧化油脂的危害。SOD和CAT是內源性抗氧化酶, 反映機體抗氧化能力強弱。本試驗, 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后, 肝臟SOD和CAT活性顯著降低(表 7), 與草魚攝食氧化魚油飼料后血清和肝臟SOD和CAT活性降低的結果一致[30]。然而, 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[31]、大口黑鱸[8]、海鯛(Sparus aurata)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[32]攝食氧化油脂飼料后, 肝臟SOD和CAT活性增加;這些不同的報道, 可能與飼料油脂的氧化程度和氧化油脂的含量不同有關。魚類攝食氧化油脂含量少, 氧化程度低時, 氧化底物增加, 機體抗氧化系統(tǒng)受到刺激, 抗氧化酶活升高; 當持續(xù)攝入高劑量的氧化油脂后, 自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破, 魚類的抗氧化系統(tǒng)受到損傷, 抗氧化酶活下降[33]。GSH是機體內源型還原性物質, 能與過氧化物結合, 消除氧化油脂危害, MDA是脂質過氧化末端產(chǎn)物之一, 攝食氧化魚油后大西洋鮭(Salmo salar)[34]、黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)[35]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[36]肝臟MDA增加, 大口黑鱸肝臟GSH降低[8]。本試驗中, 斑點叉尾鮰攝食氧化油脂飼料后, 肝臟GSH降低顯著降低, 肝臟MDA增加, 表明機體脂質過氧化程度加深。

4 結論

在本試驗條件下, 飼料含有6%氧化油脂(氧化魚油、氧化豆油、氧化混合油脂)時, 導致斑點叉尾鮰生長性能下降、皮膚黃度值增加、肝功能和抗氧化能力受損; 豆油可替代斑點叉尾鮰飼料中魚油的使用, 而不會對生長產(chǎn)生負面影響。