PLCζ對小鼠圓形精子細胞注射后卵母細胞受精及胚胎發(fā)育的影響

李冬宏，郭玉佳，林晨，陳杏婷

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，福州 350005)

1992年，Palermo等[1]成功應用卵細胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)治療嚴重少弱精子癥病人以來，ICSI在治療男性嚴重少弱精子癥取得了重大治療進展。隨后，Devrogy等[2]發(fā)現有些無精子癥患者的睪丸中存在少量精子，將這些精子應用于ICSI，獲得臨床妊娠成功。然而，仍有部分無精子癥患者無法產生正常的成熟精子，但可以從患者精液或睪丸活檢標本中收集到單倍體圓形精子細胞(round spermatid, ROS)。1994年，Ogura等[3]報道了首例ROS受精的小鼠出生，驗證了ROS與成熟精子具有同樣的受精和發(fā)育潛能。1995年，Tesarik等[4]從無精子癥患者的精液中獲得圓形精子細胞，將其注入卵子后，成功出生了2名正常的嬰兒。圓形精子細胞注射(round spermatid injection, ROSI)獲得了成功，預示著無精子癥且無法產生正常成熟精子的患者也能擁有自己的遺傳學后代。ROSI技術得以迅速發(fā)展，并且獲得了一些成功案例的報道[5-7]。但ROSI的受精率、妊娠率極低，其影響主要為：圓形精子細胞、卵母細胞激活及遺傳學等因素。因此，本研究將采用磷酸酯酶Cζ(phospholipase C zeta, PLCζ)作為ROSI后小鼠卵母細胞激活的激活劑，探討PLCζ作為激活劑的可行性及對ROSI后卵母細胞受精及胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級KM小鼠，雄鼠10只，雌鼠30只，鼠齡6～8周，體重25～30 g，購自于閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司【SCXK(閩)2017-0002】，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學實驗動物中心【SYXK(閩)2017-0014】，飼養(yǎng)環(huán)境濕度恒定，溫度(24±2)℃，適應性飼養(yǎng)一周后用于實驗。本研究通過福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批(2016038)。

1.1.2 實驗試劑

表達質粒pCRII-TOPO(見圖1)和人胚腎293T細胞(human embryonic kidney 293T cells，HEK293T)均購自BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心；瓊脂糖、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、TaKaRa LA Taq酶、1 Kbp DNA Ladder Marker、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；QIAamp DNA Mini kit購自QIAGEN公司；jetPEI轉染試劑試劑盒、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、10% NuPAGE Bis-Tris Pre-cast Gel試劑盒(Invitrogen, UK)均購自諾斯蒂克(上海)醫(yī)療器械有限公司。

圖1 真核表達質粒pCRII-TOPO DNA圖譜Figure 1 The DNA map of eukaryotic expression vector pCRII-TOPO

1.2 方法

1.2.1 質粒pCRII-TOPO- PLCζ的構建、體外表達與鑒定

采集新鮮的小鼠睪丸組織，用Trizol法提取總RNA備用。根據GenBank(NCBI Reference Sequence: NM_054066.4)中PLCζ的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，引物序列如下：上游引物ATGGATCCATGGAAAGCCAAC TTCATGA；下游引物CGCTCGAGAGTGAGAGACTT CATGGTTTG。上下游引物分別加入的酶切位點為BamHⅠ、XhoⅠ。其聚合酶鏈反應(PCR)的反應條件為：預變性95℃ 8 min、變性95℃ 45 s、退火55℃ 45 s、延伸72℃ 90 s、終延伸72℃ 5 min，30個循環(huán)。①采用基因重組技術構建真核表達質粒pCRII-TOPO- PLCζ。②采用jetPEI轉染試劑試劑盒將構建好的真核表達質粒轉染進HEK293T細胞。③將轉染質粒后的HEK293T細胞轉入含有FCS的DMEM中，并添加4 mmol谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液改換成不含FCS的DMEM。④培養(yǎng)56 h后，收集HEK293T細胞；采用裂解液裂解細胞，10% NuPAGE Bis-Tris Pre-cast Gel試劑盒(Invitrogen, UK)純化重組PLCζ蛋白。重組PLCζ蛋白經飛行質譜蛋白質組分析系統(tǒng)鑒定，并用免疫印跡法(Western blot)評價其抗原性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠圓形精子細胞顯微注射

(1)小鼠圓形精子細胞收集

取清潔級6～8周齡雄性KM小鼠雙側睪丸，剪碎后采用兩步酶消化法制備細胞懸液，將處理好的細胞懸液用PBS液洗滌三次，每次670 r/min離心10 min，洗滌完后棄上清，用睪丸細胞培養(yǎng)液混懸后待用。非連續(xù)性Percoll梯度法：將Percoll梯度液配成濃度分別為45%、60%、90%濃度梯度；吸取1 mL 45% Percoll梯度液加入15 mL錐形離心管中，然后再依次吸取1 mL 60%和90%的Percoll梯度液深入離心管管底后分次緩慢加入；最后將制好的單細胞懸液加入到密度梯度液層的最上面；室溫下，2184 r/min離心20 min；取最佳的梯度層用buffer液(1∶2)混勻；室溫下，335 r/min離心8 min，棄上清混懸后待用。

(2)顯微注射液的制備

將收集的小鼠圓形精子細胞與上述制備的重組PLCζ蛋白混合，配制成終濃度為10×10-3ng/L的混合液為實驗組；另將小鼠圓形精子細胞與HEPES混合為空白組。將處理好的PLCζ激活劑與圓形精子細胞混合液在ROSI操作皿中制成微滴，其上方位置制作HEPES微滴，置于37℃培養(yǎng)箱加熱預平衡1 h。

(3)小鼠卵母細胞獲取

選取清潔級6～8周齡KM雌性小鼠，至少控光(光照7：00 - 19：00，黑暗19：00 - 7：00)飼養(yǎng)一周后進行促排處理；于17：00對小鼠進行腹腔注射PMSG 15 IU/只，48 h后注射HCG 10 IU/L；注射HCG 15 h后，利用頸椎脫臼法處死小鼠，在腹部下側呈“V”字型打開腹腔，找到子宮與卵巢，剪下兩者之間的輸卵管放入盛有卵子處理液(HEPES)含5%胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的培養(yǎng)皿中；在體視鏡下用針刺破明顯腫脹的輸卵管壺腹部，將有液體流出，取出其中的卵丘卵母復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)；將取出的COCs在受精液(Fertilization，10% FCS)中清洗2～3次后放入盛有Fertilization液(含5% FCS)的培養(yǎng)皿中置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 h；將收集的COCs用HEPES液(5% FCS)中清洗2～3次后放入含有0.1%透明質酸酶的HEPES液中處理1 min，然后用于卵母細胞直徑相似的玻璃吸管反復吹吸去掉卵丘顆粒細胞，獲得裸卵(deruded oocytes，DOs)；將洗凈的DOs放入Fertilization液(10% FCS)，挑選出含有第一極體且形態(tài)正常的MⅡ期卵母細胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(4)圓形精子細胞注射

將獲取的卵母細胞放入HEPES微滴中，調整卵母細胞，使其第一極體位于12點或6點，持卵針于9點位置固定卵母細胞；顯微折射針挑選圓形精子細胞并回吸3個刻度(操作臂上刻度)，于3點位置刺入卵母細胞中，然后開始回吸胞質，直至破膜后立刻停止回吸，然后將圓形精子細胞緩慢注入卵母細胞胞質中，抽出注射針，固定針釋放卵母細胞；

(5)胚胎觀察

將圓形精子細胞注射后并激活的卵母細胞進行培養(yǎng)，ROSI后16～18 h(D1)觀察每個卵母細胞原核出現情況；ROSI后44～46 h(D2)觀察每個卵母細胞分裂并分級；68～70 h(D3)觀察卵裂并分級，隨即立刻轉入囊胚培養(yǎng)液(含5% FCS)中培養(yǎng)，116～118 h(D5)觀察培養(yǎng)成囊情況及分級。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究項目數據均采用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，計數資料采用率[n(%)]表示，行方差分析，其P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 質粒pCRII-TOPO- PLCζ的構建結果

以小鼠基因組為模板進行目的基因PLCζ的擴增(見圖2)。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶大小約為1960 bp，與目的基因大小相符。

注：Lane1：陰性對照；Lane2：PCR擴增PLCζ產物；Lane3∶1 Kbp DNA Ladder Marker。圖2 PCR產物凝膠電泳分析Note. Lane 1: negative control. Lane 2: PCR amplification of PLCζ products. Lane 3: 1 Kbp DNA ladder markers.Figure 2 Analysis of PCR product by gel electrophoresis

將重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ進行雙酶切鑒定(見圖3)。雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶大小分別為4000 bp和1960 bp，于原質粒pCRII-TOPO和目的基因大小相符。且經過測序，目的基因序列未發(fā)生突變。

注：Lane1：重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ雙酶切樣品；Lane2：重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ樣品；Lane3∶1 Kbp DNA Ladder Marker。圖3 重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ雙酶切電泳圖Note. Lane 1: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ double digestion sample. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ sample. Lane 3: 1 Kbp DNA ladder markers.Figure 3 Recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ double enzyme digestion electropherogram

2.2 重組PLCζ蛋白體外表達與鑒定結果

重組PLCζ蛋白經體外誘導表達后進行SDS-PAGE(見圖4)。在90 kDa附近出現大量表達蛋白條帶，與重組蛋白預計大小74×103Da相比略大。但切下該目的條帶后進行質譜鑒定，為小鼠PLCζ蛋白。

注：Lane1：蛋白Marker；Lane2：重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ誘導樣品；Lane3：空質粒pCRII-TOPO誘導樣品。圖4 體外誘導表達重組蛋白SDS-PAGE圖Note. Lane 1: protein markers. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ-induced sample. Lane 3: empty plasmid pCRII-TOPO-induced sample.Figure 4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression in vitro

對該重組PLCζ蛋白用Western blot評價其抗原性(見圖5)。在90×103Da以下出現了一條特異性條帶，大小符合重組蛋白預計大小。

注：Lane 1：蛋白Marker；Lane2：重組質粒pCRII-TOPO- PLCζ誘導樣品；Lane 3：空質粒pCRII-TOPO誘導樣品。圖5 體外誘導表達重組蛋白Western blot圖Note. Lane 1: protein markers. Lane 2: recombinant plasmid pCRII-TOPO-PLCζ-induced sample. Lane 3: empty plasmid pCRII-TOPO-induced sample.Figure 5 Western blot analysis of recombinant protein expression in vitro

2.3 小鼠ROSI后卵母細胞受精及胚胎發(fā)育結果

將小鼠圓形精子細胞與重組PLCζ蛋白混合為實驗組，另將小鼠圓形精子細胞與HEPES混合為空白組。分別進行RSOI后觀察小鼠卵母細胞的受精情況和胚胎發(fā)育情況(見圖6)。

將兩組小鼠卵母細胞的受精情況和胚胎發(fā)育情況統(tǒng)計其結果如下表1所示。實驗組的受精率高于空白組，兩者之間的差異無顯著性(P>0.05)。但實驗組的2-4細胞率、8細胞率及成囊率均要略低于空白組，兩者之間的差異無顯著性(P>0.05)。

注：a：小鼠卵母細胞受精圖；b：小鼠胚胎2-4細胞分裂圖；c：小鼠胚胎8細胞及桑椹胚圖；d：小鼠胚胎囊胚圖。圖6 小鼠ROSI后卵母細胞受精及不同時期胚胎發(fā)育圖Note. a: mouse oocyte fertilization map after ROSI. b: mouse embryo two- to four-cell division graph. c: mouse embryo eight-cell stage and mulberry embryo graph. d: mouse embryo blastocyst graph.Figure 6 The fertilization map of mouse oocytes after ROSI and the embryo development map in different period

組別Groups受精率%(受精數/卵母細胞數)Fertilization rate%(No. Fertilization/No. MⅡ)2-4細胞率%(2-4細胞數/受精數)2-4 cell rate%(No. 2-4 cell/No. Fertilization)8細胞率%(8細胞數/受精數)8 cell rate%(No. 8 cell/No. Fertilization)成囊率%(囊胚數/受精數)Blastocyst formation rate%(No. blastocyst/No. Fertilization)空白組Blank group39.33(59/150)69.49(41/59)67.80(40/59)40.68(24/59)實驗組Test group42.00(63/150)68.25(43/63)63.49(40/63)34.92(22/63)χ2/P值χ2/P value0.221/0.6380.022/0.8830.250/0.6170.619/0.432

3 結論

PLCζ是存在于脊椎動物精子中的一種特異性磷脂酶C，屬于磷脂酶C家族的一員，為可溶性的單鏈結構，通過PLCζ介導磷脂酰肌醇信號通路[8]。PLCζ催化活性部分是高度保守的X區(qū)和Y區(qū)，該區(qū)酶蛋白經折疊靠近后形成催化活性中心，具有PLC的典型結構。XY結構區(qū)域分別含有170個氨基酸殘疾和260個氨基酸殘基，若其中一個氨基酸殘基發(fā)生突變，PLCζ則會失去生物活性導致引發(fā)鈣振蕩的能力喪失[9-10]。Kashir等[11]利用人類細胞系表達重組人類PLCζ蛋白，將該蛋白注入小鼠卵子中，能夠產生與正常受精相同的Ca2+振蕩模式。再者Saunders等[8]將小鼠PLCζ mRNA注射入成熟卵子中也可引發(fā)與受精時相似的Ca2+振蕩，而去除了PLCζ則不能引發(fā)卵母細胞Ca2+振蕩。Joncs等[12]證實了精子中PLCζ活性要比其他組織高出2倍以上，單條精子的含量就可以引起Ca2+振蕩。雖然目前研究已證實PLCζ可以引發(fā)卵母細胞發(fā)生Ca2+振蕩，但PLCζ可否作為一種ROSI后卵母細胞的激活劑以及激活后對胚胎受精發(fā)育是否有影響，迄今為止研究甚少。因此，本研究將采用PLCζ作為ROSI后卵母細胞激活的激活劑，探討PLCζ作為激活劑的可行性及對ROSI后卵母細胞受精及胚胎發(fā)育的影響。

本研究中成功構建了真核表達載體pCRII-TOPO-PLCζ，并在體外表達了重組PLCζ蛋白，且具有良好的抗原特性。但是將重組PLCζ蛋白作為小鼠ROSI后的卵母細胞激活劑，卵母細胞受精率略高于空白組，但不具有顯著差異。PLCζ是影響男性生殖與不育的關鍵因素，也是一種重要的激活卵母細胞的精子因子。研究發(fā)現不能引發(fā)Ca2+振蕩的都是因為精子的PLCζ出現異常[13]。但Swann等[14]研究表明沒有功能的PLCζ不會影響精子的發(fā)生及精子質量參數，如精子活力、活動率和頂體反應能力。由于本研究沒有對重組的PLCζ進行功能評價，可能是本研究中卵母細胞受精率沒有發(fā)生顯著變化這一陰性結果的原因之一，因此PLCζ對卵母細胞受精及胚胎發(fā)育無影響還需進一步實驗驗證。另外研究結果還顯示2-4細胞率、8細胞率及成囊率卻略低于空白組，卻不具有顯著差異，分析其原因可能是提純的重組蛋白中含有其他種類的蛋白，會對胚胎的生長發(fā)育產生某些輕微影響，但目前尚無文獻報道。

目前關于Ca2+振蕩對于卵子最佳激活和隨后胚胎發(fā)育的重要性已有相當的爭論。改變Ca2+的數量和瞬變的頻率可以微妙的影響胚胎基因的表達與發(fā)展?jié)摿15]，但也有研究結果顯示未檢測到任何形式的Ca2+會影響缺失PLCζ精子的ICSI結果[16]。正如Hachem等[17]學者所述，現今由于精子不能誘導活化卵子造成的男性不育現象可以通過人為的干預(如機械法、電子法或化學刺激法)來刺激誘導卵子活化的方法來處理此類男性不育。但是這些處理誘導的Ca2+都是非生理性的，對人類發(fā)育的長期影響仍未明確，是值得廣大醫(yī)學工作者重點關注的問題。綜上所述本研究中重組PLCζ蛋白對卵母細胞受精及胚胎發(fā)育無顯著影響，作為小鼠ROSI后的卵母細胞激活劑的可行性值得商榷。