電針聯(lián)合甲強龍對椎間盤脫出大鼠的有效性和安全性研究

張榮，紀婷，饒宇騰，姜代勛，李佳，陳武*

(1.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)2. 寵福鑫中西結(jié)合國際動物診療中心，北京102206)

甲潑尼龍琥珀酸鈉(methylprednisolone sodium succinate，MPSS，甲強龍)作為一種強效的甾體類抗炎藥，常被用于臨床治療急性脊髓損傷性炎癥。但是，對其在椎間盤脫出治療中的有效性見解不一，對損傷超過8 h的有效性多為否定意見[1-2]。我們在獸醫(yī)臨床通過大量的案例觀察到，電針聯(lián)合甲強龍對犬的椎間盤脫出療效顯著，即使發(fā)病超過48 h甚至一周以上的患犬的恢復(fù)過程也明顯快于單獨使用甲強龍或單獨電針組。針灸的基本作用原理是調(diào)動調(diào)節(jié)機體固有機能，電針是否通過某種機制與甲強龍產(chǎn)生協(xié)同作用需要進一步研究。為此，本試驗以大鼠為模型，觀察了電針聯(lián)合甲強龍組(EA+MP)，單獨電針組(EA)和甲強龍組(MP)對運動機能、脊髓神經(jīng)細胞尼氏小體的影響和副作用的發(fā)生率等，以期為臨床運用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠112只，雌雄不限，體重(200±20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院動科樓九層屏障環(huán)境中【SYXK(京)2015-0004】，保證供給實驗動物充足的飲水與食物,環(huán)境溫度(24±2)℃，濕度50%～70%。本實驗得到北京農(nóng)學(xué)院動物倫理委員會許可(倫理審查批準編號:2012-0611)。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

顯微鑷(上海金鐘手術(shù)器械廠，WT3080)；自制硅膠墊片(長4 mm、寬2 mm、厚1 mm， 取材于6Fr無菌雙腔導(dǎo)尿管，CREATE MEDIC CO．，LTD.，日本)；電針儀(北京欣東華電子儀器有限公司，WQ-6F)；針灸針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司，0.2 mm×25 mm)；組織脫水機(上海徠卡儀器有限公司，EG1150H)；石蠟包埋機(上海徠卡儀器有限公司，EG1160)；石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司，RM2235)；展片機(天津天利航空機電有限公司，ZPJ-1 A)；倒置熒光顯微鏡(Olympus，RE-3000)；多賴處理防脫片(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，17010501)；尼氏染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C0117)；戊巴比妥鈉(Sigma，57-33-0)；無水乙醇(北京化工廠，20170216)；二甲苯(北京化工廠，20170216)；中性樹膠(上海標本模型廠，規(guī)格：100 g/瓶)。

1.2 方法

1.2.1 分組

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開始試驗， 隨機分為分別為假手術(shù)Sham組(20只)、模型Model組(20只)、甲強龍MP組(24只)，電針EA組(24只)，電針聯(lián)合甲強龍EA+MP組(24只)。各組按取樣時間點分4個亞組。

1.2.2 模型制備及穴位選取

大鼠椎間盤模型參照盧知松等的方法制作[3]。腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)，胸腰結(jié)合處背正中線部位剃毛、消毒，背側(cè)做2 cm切口切開第一腰椎(L1)至第二腰椎(L2)處，鈍性分離肌肉組織，剝離背最長肌和多裂肌，至完全暴露L1與L2之間相連接的關(guān)節(jié)突，用咬骨鉗于L1和L2椎間孔避開神經(jīng)根及血管，分別向前向后各咬掉L1及L2側(cè)椎板的1/2，暴露脊髓。Model組、MP組、EA組和EA+MP組大鼠用自制硅膠片 (4 mm×2 mm×1 mm)填塞入胸腰椎結(jié)合部脊髓腹側(cè)，Sham組不填塞，生理鹽水沖洗創(chuàng)口并清理殘留血液，切口逐層常規(guī)縫合。術(shù)后按分組分籠飼養(yǎng)，完全清醒后不做任何處理飼養(yǎng)24 h后進行Basso、Beattie and Bresnahan(BBB)評分，BBB評分壓迫側(cè)后肢介于0-2分、對側(cè)后肢介于0-10分者，納入實驗，隨機分組，評分不符合實驗要求者做淘汰處理，數(shù)量不足組進行補齊。

EA組及EA+MP組進行電針治療所選穴位：左右膀胱俞；左右足三里、趾間。分別接電針儀，連續(xù)波，頻率2 Hz、輸出以每只大鼠所能耐受最大強度為準，每天1次20 min，至取樣時間進行取樣。

1.2.3 處理方法

各組大鼠造模后常規(guī)飼養(yǎng)24 h開始相應(yīng)處理，記為實驗第0天。

(1)Sham組

僅暴露脊髓，不填塞墊片，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

(2)Model組

暴露脊髓并填塞墊片，造成椎間盤脫出大鼠模型，壓迫程度符合實驗要求者入組，常規(guī)飼養(yǎng)不做任何處理。

(3)EA+MP組

暴露脊髓并填塞墊片，造成椎間盤脫出大鼠模型，壓迫程度符合實驗要求者入組，于實驗第0天開始先電針20 min，后給甲強龍按30 mg/kg劑量腹腔注射給藥，實驗第1天仍先電針20 min后再次給藥，第2天開始每日僅針灸；

(4)EA組

暴露脊髓并填塞墊片，造成椎間盤脫出大鼠模型，壓迫程度符合實驗要求者入組，于實驗第0天開始，每日針灸1次，每次電針20 min。

(5)MP組

暴露脊髓并填塞墊片，造成椎間盤脫出大鼠模型，壓迫程度符合實驗要求者入組，于實驗第0天開始，按NASCISⅢ所述給藥方案[4]，采用30 mg/kg腹腔注射，1～48 h內(nèi)選取4個時間點按5.4 mg/(kg·h)藥量腹腔注射給藥。

1.2.4 實驗大鼠BBB評分

對大鼠實施造模手術(shù)24 h后，采用BBB評分法[5]對大鼠雙后肢運動情況進行觀察與評價。實驗過程中保證同一名實驗員每天采用大鼠BBB運動機能評分方法，于實驗開始第0天對大鼠左、右后肢分別評分。BBB評分總分21分，得分越高運動機能越好。

1.2.5 實驗大鼠脊髓神經(jīng)元病理變化觀察

各組大鼠于相應(yīng)時間點(實驗第1、3、7、14天)腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)，呈U 型剪開胸部，暴露心臟、剪破左心房，主動脈弓處插入0.7×25 TWLB靜脈輸液針，0.9%生理鹽水快速灌注直至肝臟發(fā)白。于冰盒上快速剪下脊髓壓迫部位，正中向頭0.3 cm用于尼氏染色，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定后4℃冰箱備用，向尾側(cè)0.5 cm置于-80℃冰凍保存用于其他檢測。用于尼氏染色段脊髓經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片及烘干等步驟制備石蠟切片，層厚5 μm。常規(guī)切片脫蠟至水，尼氏染液室溫下染色3～10 min，取出切片，蒸餾水快速沖洗后常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察脊髓神經(jīng)元尼氏小體，并于400倍鏡下拍照。

1.2.6 大鼠活躍度及安全性觀察

每日安排同一位觀察人員對各組大鼠的活躍度及體況進行觀察、評分。

對大鼠的活躍度進行評分(1-4分)，評分標準為：1分：大鼠萎靡、蜷縮、對外界環(huán)境反應(yīng)弱、進食進水減少；2分：大鼠不愛運動、進食進水正常；3分：大鼠機警、主動進食進水、偶爾活動；4分：大鼠活潑、爬籠子玩耍、互相打鬧。

對大鼠體況進行觀察記錄：觀察、記錄大鼠是否出現(xiàn)如血尿、抽搐等異常癥狀，并對其發(fā)生率進行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠BBB運動功能評分

BBB評分結(jié)果如圖1，術(shù)后各時間點，Model組大鼠運動功能評分均顯著降低，與Sham組比較差異有顯著性(P< 0.05)。治療3、7、14 d時間點，MP組、EA組、EA+MP組大鼠左右后肢肢體運動功能評分均有所升高。

對左后肢(壓迫側(cè))BBB評分數(shù)據(jù)進行分析：EA+MP組3、7 d時與EA組、MP組比較差異有顯著性(P< 0.05)。EA+MP組7、14 d時與Sham組水平接近(P> 0.05)；MP組、EA組14 d時與Sham組水平接近(P> 0.05)；Model組在全部時間點均與Sham組相比差異有顯著性(P< 0.05)。EA+MP組與EA組在3、7、14 d時與Model組比較差異有顯著性(P< 0.05)；MP組在7、14 d時與Model組比較差異有顯著性(P< 0.05)。

對右后肢(非壓迫側(cè))BBB評分數(shù)據(jù)進行分析：EA+MP組3、7 d時與MP組比較差異有顯著性(P< 0.05)。EA+MP組、EA組在3、7、14 d時與Sham組水平接近(P> 0.05)；MP組在14 d時與Sham組水平接近(P> 0.05)；Model組各時間點與Sham組比較均差異有顯著性(P< 0.05)。EA+MP組、MP組在1、3、7、14 d時與Model組相比差異有顯著性(P< 0.05)；EA組在3、7、14 d時與Model組相比差異有顯著性(P< 0.05)。

以上結(jié)果表明，三組治療組均能不同程度改善椎間盤脫出發(fā)生24 h后大鼠的肢體運動功能，其中電針聯(lián)合甲強龍組在起效時間及改善程度上均優(yōu)于甲強龍組及電針組。(見圖1)

2.2 尼氏染色觀察各組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞變化結(jié)果

染色結(jié)果顯示：Sham組(圖2-E)神經(jīng)元形態(tài)正常，尼氏小體數(shù)量較多，著色均勻，胞體呈藍紫色染色。1 d的Model組(圖2-A1)神經(jīng)細胞數(shù)量減少，胞體皺縮，細胞結(jié)構(gòu)受損，部分細胞和周圍尼氏小體破碎消失；EA+MP組(圖2-B1)、EA組(圖2-C1)、MP組(圖2-D1)均有部分神經(jīng)細胞腫脹破碎，尼氏小體消失，其中EA+MP組相比其他各組損傷程度最輕，損傷的神經(jīng)細胞數(shù)量較少，仍保留較多形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的神經(jīng)元細胞；3 d的Model組(圖2-A2)神經(jīng)細胞損壞明顯，細胞核周邊尼氏小體破碎消失，細胞質(zhì)染色不明顯；EA+MP組(圖2-B2)相比其他各組保留的正常神經(jīng)元細胞最多；EA組(圖2-C2)及MP組(圖2-D2)細胞形態(tài)略好于Model組(圖2-A2)，EA組可見神經(jīng)元胞體腫脹、尼氏小體空泡化、細胞質(zhì)染色變淺；MP組神經(jīng)元胞體萎縮，尼氏小體數(shù)量減少，細胞質(zhì)染色變淺；7 d的Model組(圖2-A3)可見損傷區(qū)神經(jīng)元大量壞死，胞體腫脹、出現(xiàn)空泡樣細胞，尼氏染色較淺，視野內(nèi)可見膠質(zhì)細胞增生；EA+MP組(圖2-B3)神經(jīng)元數(shù)量增加，少有細胞破損，部分尼氏小體減少，細胞質(zhì)深染；EA組(圖2-C3)及MP組(圖2-D3)正常神經(jīng)元數(shù)量、尼氏小體染色深度均優(yōu)于3 d時，仍有部分神經(jīng)元胞體腫脹破損，尼氏小體染色深度均介于模型組與電針聯(lián)合甲強龍組之間，二者間甲強龍組神經(jīng)元形態(tài)較好；14 d時，除Model組(圖2-A4)神經(jīng)細胞損壞嚴重，尼氏小體破碎消失染色變淺之外，其他各組正常神經(jīng)元數(shù)量雖仍少于Sham組(圖2-E)，但均有不同程度增加，其中EA+MP組(圖2-B4)神經(jīng)細胞形態(tài)較正常，尼氏小體數(shù)量明顯增多，且核仁、尼氏小體清晰可見，著色均勻。

可見，椎間盤脫出24 h后給予電針聯(lián)合甲強龍治療、電針治療或甲強龍治療均可不同程度降低神經(jīng)細胞損傷、防止細胞腫脹、尼氏小體破碎消失，其中電針聯(lián)合甲強龍療法效果最佳，能夠較好的改善神經(jīng)細胞形態(tài)，增加尼氏小體數(shù)量，進而提高神經(jīng)細胞功能活性。見圖2。

2.3 安全性及活躍度觀察

對各組大鼠的安全性進行觀察記錄：甲強龍組出現(xiàn)副作用大鼠共9只，其中3只出現(xiàn)血尿(未死亡)、6只不明原因死亡，部分死亡前抽搐，最終甲強龍組一共消耗30只，副作用發(fā)生率30%，死亡率20%；電針聯(lián)合甲強龍組1只出現(xiàn)血尿(未死亡)，副作用發(fā)生率4.16%，死亡率0；電針組副作用發(fā)生率0，死亡率0。

對各組大鼠活躍度進行觀察評分：電針聯(lián)合甲強龍組3.8分，電針組3.6分，甲強龍組1.5分。甲強龍組存活大鼠整體消瘦，精神狀態(tài)一般，安靜；另外兩組針灸大鼠整體狀態(tài)活躍，體態(tài)豐滿，恢復(fù)行走的大鼠，大多有打鬧、爬籠子等行為，表明電針治療或電針聯(lián)合甲強龍治療可降低其不適感，有效改善椎間盤脫出大鼠生活質(zhì)量，且副作用發(fā)生率相比甲強龍組明顯降低。

3 討論

椎間盤脫出致病的本質(zhì)是從纖維環(huán)脫出到椎管的髓核壓迫脊髓造成的急性脊髓損傷。急性脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷兩個主要階段。直接損傷作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的同時也造成缺血、缺氧等繼發(fā)性，引發(fā)一系列的生化級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷范圍不斷擴大[6-7]，同時發(fā)生鄰近神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞凋亡、壞死。所以在發(fā)生椎間盤脫出后，如何有效減緩原發(fā)性和繼發(fā)性損傷是治療的關(guān)鍵。

注：與Sham組比較，a P< 0.05；與Model組比較，△P< 0.05；與EA+MP組比較，#P< 0.05。圖1 各組大鼠左后肢、右后肢運動功能評分比較Note. Compared with the Sham group, a P<0.05. Compared with the Model group, △P<0.05. Compared with EA+MP group, #P<0.05.Figure 1 Motor function scores of left and right hindlimbs in the rat models of intervertebral disc extrusion

注：A．Model組，B．EA+MP組，C．EA組，D．MP組，E．Sham組；1．1 d時間點，2．3 d時間點，3．7 d時間點， 4．14 d時間點。圖2 各組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞變化(Nissl染色，× 40)Note. A. Model group, B. EA+MP group, C. EA group, D. MP group, E. Sham group. 1. 1 d, 2. 3 d, 3. 7 d, 4. 14 d.Figure 2 Using Nissl staining to observe Nissl bodies of each group (×40)

甲強龍(MPSS)被認為具有改善神經(jīng)傳導(dǎo)興奮、促進脊髓血液循環(huán)、減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、穩(wěn)定細胞膜通道、促進鈣離子外流、抑制傷后兒茶酚胺水平增高，抑制損傷局部白細胞介素類物質(zhì)釋放，從而達到減緩脊髓水腫、炎癥反應(yīng)的效果[8-9]，因此在脊髓損傷的治療中廣受期待。美國急性脊髓損傷研究會(NASCIS)給出了使用甲強龍的推薦標準[4,10-11]，但其有效作用時間規(guī)定為損傷8 h內(nèi)，且需注意引起的副作用。大量文獻記載MPSS的使用可能增加感染風(fēng)險[2,4,10-12]，相似的情況也發(fā)生在動物上，多項研究還表明使用糖皮質(zhì)激素的患犬出現(xiàn)胃腸道出血和潰瘍的風(fēng)險較高[13-14]，而獸醫(yī)臨床上大量的病例多在發(fā)病1 d后，甚至幾天后才會就診，給甲強龍的使用帶來極大的困惑。

然而，我們在臨床中對經(jīng)過核磁確診的44例椎間盤脫出引起的1-5級癱瘓犬，采用了以電針為主，早期結(jié)合甲強龍短時間的沖擊療法(先電針20 min后即刻，30 mg/kg,1 h內(nèi)靜注，連用2 d)，其中41例患犬在2周內(nèi)不同程度恢復(fù)行走，該數(shù)據(jù)表明，電針聯(lián)合甲強龍方法對于恢復(fù)IVDD患犬行走能力的有效率超過93%，顯示了極高的臨床價值。

犬椎間盤脫出屬“痿癥”的范疇，脊髓氣血的不足或氣滯血瘀是該病的基本病理[15-16]，針灸療法理應(yīng)最為對癥。我們之前的研究通過臨床病例和動物模型證明電針治療可在壓迫持續(xù)存在下改善脊髓的血液循環(huán)[3]，恢復(fù)臨床患犬和模型犬的神經(jīng)機能和運動機能，并長期保持穩(wěn)定[17]，說明解除脊髓壓迫并非治療椎間盤脫出導(dǎo)致癱瘓的必須條件。這些動物試驗的結(jié)果，無可辯駁地證明針灸療效的客觀性，而絕不是所謂的主觀性“心理安慰”作用； 這點在本研究的大鼠運動機能的BBB評分也得到再次證明(圖1)。

尼氏小體為神經(jīng)元胞體或樹突內(nèi)大的嗜堿性團塊和顆粒，是神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的主要場所。尼氏小體大而數(shù)量多，表明神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)功能較強。本研究觀察到 EA+MP組尼氏小體的形態(tài)和數(shù)量顯著優(yōu)于對照組，且甲強龍的副作用發(fā)生率僅為4.16%。提示電針聯(lián)合甲強龍具有增強保護神經(jīng)細胞形態(tài)、增加尼氏小體數(shù)量，進而改善肢體運動機能，且有效降低甲強龍副作用發(fā)生率，提高動物生存質(zhì)量的功效。這一作用，可能與電針迅速改善脫出模型受壓脊髓的微循環(huán)，增強損傷局部甲強龍的輸送與療效的發(fā)揮有關(guān)。

本研究表明，對椎間盤脫出超過8 h(即超過甲強龍最佳治療時間窗)后的病例，采用電針聯(lián)合甲強龍進行治療為有效治療方案，建議臨床參考使用。