高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的驗(yàn)證及其診療效能評(píng)估

崔 戈，馮文明，張 婷，朱國良，石麒麟，張曉嵐，夏 慧

湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1病理科 2外科，浙江湖州 313000 3湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理教研室，浙江湖州 313000

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究顯示8.1%～18.0%的結(jié)直腸癌患者并發(fā)糖尿病[1-4]；高血糖狀態(tài)是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者具有更高的結(jié)直腸癌發(fā)生率、更差的預(yù)后和更高的死亡率[1-5]。高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者腫瘤直徑更大、分化程度更差[6]，提示血糖狀態(tài)與結(jié)直腸癌的惡性程度密切關(guān)聯(lián)。2型糖尿病與結(jié)直腸癌具有諸多共同發(fā)病因素,如肥胖、高熱量飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)等[1-4]，但糖代謝異常與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)尚不十分明確。對(duì)不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌進(jìn)行差異性表達(dá)基因篩選、大樣本量驗(yàn)證及功能機(jī)制研究，尋找特異性標(biāo)志分子和關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)糖代謝異常相關(guān)結(jié)直腸癌的早期篩查、揭示關(guān)鍵分子作用、構(gòu)建個(gè)體化分子靶向治療策略均具有重要意義。國外有全基因組關(guān)聯(lián)研究報(bào)道了糖尿病與結(jié)直腸癌存在關(guān)聯(lián)的某些基因，如轉(zhuǎn)錄因子7類似物2、電壓依賴鉀通道蛋白1、高遷移率族蛋白A2、Rho GTP酶結(jié)合蛋白及人骨形態(tài)形成蛋白拮抗蛋白1等[2]。目前國內(nèi)未見關(guān)于不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌組織高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、信息學(xué)分析及大樣本量組織表達(dá)驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道。本研究組前期采用Illumina Hiseq第2代測(cè)序平臺(tái)對(duì)不同血糖狀態(tài)的結(jié)直腸癌組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及信息學(xué)分析，篩選了一批在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌組織中顯著高表達(dá)的基因，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、NADPH 氧化酶-1(NADPH oxidase-1，NOX1)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)、熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)、組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)，有研究表明上述基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及能量代謝均存在關(guān)聯(lián)[7-19]，可能是高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌的潛在標(biāo)志分子。本研究采用大樣本量組織驗(yàn)證上述5種基因mRNA表達(dá)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)，采用診斷試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)相關(guān)基因的診斷效能。

資料和方法

臨床樣本收集及預(yù)處理本研究經(jīng)主管部門醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所有樣本提供者本人或其家屬均簽署知情同意書后，開展臨床樣本的收集及預(yù)處理工作。結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤手術(shù)切除樣本經(jīng)2位以上病理科高年資診斷醫(yī)師診斷為“結(jié)直腸癌”，病理診斷結(jié)果作為定性“金標(biāo)準(zhǔn)”；上述確診的結(jié)直腸癌患者為首次入院，未曾接受放射治療、化學(xué)治療或中醫(yī)中藥等任何腫瘤治療；排除并發(fā)急慢性感染、臟器功能損害等其他病癥。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)高年資臨床醫(yī)生結(jié)合臨床癥狀及空腹血糖檢驗(yàn)，結(jié)果符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[20-21]：糖尿病為空腹血糖≥7.0 mmol/L或有糖尿病癥狀，任何時(shí)間靜脈血漿葡萄糖濃度≥11.1 mmol/L；高血糖狀態(tài)為空腹血糖>6.1 mmol/L，正常人空腹血糖參考值為3.9～6.1 mmol/L。上述糖尿病患者未曾接受任何降糖治療，并經(jīng)影像學(xué)和/或活檢病理診斷無伴發(fā)腫瘤病。健康志愿者樣本：志愿者的體檢結(jié)論為正常，血糖值正常，經(jīng)其他檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤、急慢性感染、臟器功能損害等其他病癥。選取本院規(guī)范化臨床生物樣本庫庫存109例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除腫瘤組織、遠(yuǎn)端正常腸組織及其外周靜脈血。另選取本院30例內(nèi)分泌科糖尿病患者及30例健康志愿者，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空負(fù)壓采血管收集空腹外周靜脈血5 ml，離心后吸取血清，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

血糖狀態(tài)統(tǒng)計(jì)及臨床樣本分組采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)上述樣本提供者清晨空腹靜脈血漿葡萄糖血糖值(單位mmol/L)，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。臨床樣本分組：根據(jù)血糖狀態(tài)及組織良惡性，將結(jié)直腸癌患者組織樣本分為4組：伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者腫瘤組織(high glucose-tumor，HG-T)、伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織(high glucose-normal tissue，HG-N)、正常血糖結(jié)直腸癌患者腫瘤組織(normal glucose-tumor，NG-T)、正常血糖結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織(normal glucose-normal tissue，NG-N)。血清樣本分組：根據(jù)血糖狀態(tài)及是否伴發(fā)結(jié)直腸癌，將外周血血清樣本分為4組：HG-T組、NG-T組、糖尿病組、健康組。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用ABI-7300實(shí)時(shí)定量檢測(cè)儀(SYBR Green法)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取上述組織/血清樣本經(jīng)總RNA抽提試劑充分裂解，離心取上清，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)PCR引物：GRP78：上游5’ ATAGCAGAAGCCGACAGG 3’，下游5’ CCAGTGAGACCAGCAATG 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp；NOX1：上游5’ ATAGCAGAAGCCGACAGG 3’，下游5’ CCAGTGAGACCAGCAATG 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp；CEACAM5：上游5’ CAGCCTCACTTCTAACCTTC 3’，下游5’ TGCCATCCACTCTTTCAC 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度165 bp；HSP60：上游5’ ATCAGGAGAGGTGTGATGTTAG 3’，下游5’ TCCGTTTGCAGAAATCGTAG 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度117 bp；HDAC1：上游5’ GCTCCACATCAGTCCTTCC 3’，下游5’ GGTCGTCTTCGTCCTCATC 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度176 bp；內(nèi)參GAPDH：上游5’ CACCCACTCCTCCACCTTTG 3’，下游5’ CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度110 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件按照試劑盒要求操作，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min)，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算每個(gè)樣本目標(biāo)基因擴(kuò)增達(dá)熒光閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)及內(nèi)參基因Ct值，mRNA表達(dá)水平以2-△△Ct法計(jì)算相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量，采用ABI Prism 7300 SDS軟件分析結(jié)果。

結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)統(tǒng)計(jì)并分析其與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)入組結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)：包括性別、年齡、腫瘤部位、大體分型、腫瘤直徑、神經(jīng)/血管累及、分化程度、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期。腫瘤病理類型及分化級(jí)別診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[22]確定。原發(fā)腫瘤(T)：T0：無原發(fā)腫瘤證據(jù)；Tis：原位癌；T1：腫瘤侵犯黏膜下層；T2：腫瘤侵犯固有肌層；T3：腫瘤穿透固有肌層到達(dá)漿膜下層或侵犯無腹膜覆蓋的結(jié)直腸旁組織；T4：腫瘤穿透腹膜臟層或直接侵犯或黏連于其他器官或結(jié)構(gòu)。區(qū)域淋巴結(jié)(N)：N0：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N1：有1～3枚區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N2：有4枚以上區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)：M0：無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；M1：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。TNM分期參照2009年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)/國際抗癌聯(lián)盟結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(第7版)[23]登記。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間各基因mRNA表達(dá)均值的差異性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，并進(jìn)行Bonferroni校正，P<0.01為兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)直腸癌患者血清樣本中相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)變量間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)相關(guān)系數(shù)r，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用診斷試驗(yàn)方法計(jì)算相關(guān)基因在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、正確指數(shù)、陽性及陰性似然比、陽性及陰性預(yù)測(cè)值；以靈敏度為縱坐標(biāo)、假陽性率為橫坐標(biāo)作圖，繪制受試者工作特性曲線(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計(jì)算ROC曲線下面積(area under curve，AUC)及其95%可信區(qū)間，以評(píng)價(jià)診斷效能并選擇最佳診斷界限值。根據(jù)ROC曲線坐標(biāo)結(jié)果，計(jì)算正確指數(shù)=敏感度-(1-特異性)，以最大正確指數(shù)對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)量作為診斷臨界點(diǎn)。在病理診斷為“結(jié)直腸癌”患者的血清樣本中，將mRNA表達(dá)量大于或等于診斷臨界點(diǎn)者作為真陽性表達(dá)數(shù)(a)，小于診斷臨界點(diǎn)者作為假陰性表達(dá)數(shù)(c)；在其他人群(正常血糖結(jié)直腸癌患者、糖尿病患者及健康志愿者)的血清樣本中，將mRNA表達(dá)量大于或等于診斷臨界點(diǎn)者作為假陽性表達(dá)數(shù)(b)，小于診斷臨界點(diǎn)者作為真陰性表達(dá)數(shù)(d)，制作4格表，根據(jù)表格數(shù)據(jù)計(jì)算相應(yīng)指標(biāo)：靈敏度=a/(a+c)×100%；特異度=d/(b+d)×100%；準(zhǔn)確度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%；正確指數(shù)=[a/(a+c)+d/(b+d)]-1；陽性似然比=[a/(a+c)]/[b/(b+d)]×100%，陰性似然比=[c/(a+c)]/[d/(b+d)]×100%；陽性預(yù)測(cè)值=a/(a+b)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=d/(c+d)×100%。分別通過平行實(shí)驗(yàn)、序列實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多個(gè)基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，篩選優(yōu)化出靈敏度和特異度較高的標(biāo)志組合。

結(jié) 果

結(jié)直腸癌患者血糖狀態(tài)根據(jù)空腹血糖狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，109例結(jié)直腸癌患者中血糖正常者(空腹血糖狀態(tài)為3.9～6.1 mmol/L)為75例，占結(jié)直腸癌患者總數(shù)的68.80%；高血糖狀態(tài)者(空腹血糖>6.1 mmol/L)為34例，占結(jié)直腸癌患者總數(shù)的31.19%；其中并發(fā)糖尿病者(空腹血糖≥7.0 mmol/L并經(jīng)臨床確診)為18例，占結(jié)直腸癌患者總數(shù)的16.51%。

不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者腫瘤與正常組織相關(guān)基因mRNA的表達(dá)分別對(duì)HG-T、HG-N、NG-T及NG-N組組織的mRNA表達(dá)量進(jìn)行兩兩組間比較，采用t檢驗(yàn)比較組間各基因mRNA表達(dá)均值的差異性，并經(jīng)Bonferroni校正。結(jié)果顯示，與遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織相比，高血糖或正常血糖狀態(tài)的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的GRP78 (P=0.000，P=0.006)、NOX1(P=0.000，P=0.002)、CEACAM5(P=0.000，P=0.000)、HSP60(P=0.000，P=0.000)、HDAC1 (P=0.000，P=0.001) mRNA均顯著增高。與正常血糖狀態(tài)的結(jié)直腸癌腫瘤組織相比，NOX1(P=0.000)、HDAC1(P=0.030)在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌腫瘤組織中顯著高表達(dá)，其余基因差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常血糖狀態(tài)的結(jié)直腸遠(yuǎn)端正常組織相比，HDAC1在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸遠(yuǎn)端正常組織中顯著高表達(dá)(P=0.017)(表1)。

不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清相關(guān)基因mRNA表達(dá)差異分別對(duì)伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者、正常血糖結(jié)直腸癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清的mRNA表達(dá)量進(jìn)行兩兩組間比較，采用t檢驗(yàn)比較組間各基因mRNA表達(dá)均值的差異性，經(jīng)Bonferroni校正。結(jié)果顯示，與糖尿病患者及健康志愿者血清樣本相比，不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者上述基因mRNA表達(dá)均顯著增高；高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者與正常血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者血清樣本相比，NOX1(P=0.008)、HSP60(P=0.001)及HDAC1(P=0.000)基因mRNA表達(dá)顯著增高，其余基因差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性在不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析中，GRP78(P=0.001)、NOX1(P=0.022)、CEACAM5(P=0.000)、HSP60(P=0.044)、HDAC1(P=0.047)基因mRNA表達(dá)分別與空腹血糖狀態(tài)呈顯著正相關(guān)；GRP78 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌血管累及呈顯著正相關(guān)(P=0.016)，NOX1 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤直徑呈顯著正相關(guān)(P=0.013)，CEACAM5 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌血管累及(P=0.036)、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度(P=0.036)、TNM分期(P=0.014)均呈顯著正相關(guān)；HSP60 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡呈顯著正相關(guān)(P=0.030)；HDAC1 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)病部位(P=0.049)、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度(P=0.025)、TNM分期(P=0.042)分別呈顯著正相關(guān)(表3)。

表1 不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者腫瘤與正常組織相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)比較Table 1 Comparison of mRNA relative expressions of genes between tumor and normal tissues in colorectal cancer patients with different blood glucose levels

GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；NOX1：NADPH 氧化酶-1； CEACAM5：癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5；HSP60：熱休克蛋白60；HDAC1：組蛋白去乙?；?；HG-T：伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者腫瘤組織；NG-T：正常血糖結(jié)直腸癌患者腫瘤組織；HG-N：伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織；NG-N：正常血糖結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)端正常腸黏膜組織；t1、P1：HG-T比NG-T；t2、P2：NG-T比NG-N；t3、P3：HG-N比NG-N；t4、P4：HG-T比HG-N

GRP78：glucose regulated protein 78；NOX1：NADPH oxidase-1；CEACAM5：carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5；HSP60：heat shock protein 60；HDAC1：histone deacetylase 1；HG-T：tumor in colorectal cancer patients with high glucose levels；NG-T：tumor in colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；HG-N：normal tissues in colorectal cancer patients with high blood glucose levels；NG-N：normal tissues in colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；t1，P1：HG-Tvs. NG-T；t2，P2：NG-Tvs. NG-N；t3，P3：HG-Nvs. NG-N；t4，P4：HG-Tvs.HG-N

表2 不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)比較Table 2 Comparison of mRNA relative expressions of genes in serum of colorectal cancer patients with different blood glucose levels，diabetic patients，and healthy volunteers

HG-T：伴發(fā)高血糖結(jié)直腸癌患者血清； NG-T：正常血糖結(jié)直腸癌患者血清；DM：糖尿病患者血清；N：健康志愿者血清；t1、P1：HG-T比NG-T；t2、P2：HG-T比DM；t3、P3：NG-T比N；t4、P4：DM比N；t5、P5：HG-T比N

HG-T：serum of colorectal cancer patients with high blood glucose levels；NG-T：serum of colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；DM：serum of diabetic patients；N：serum of healthy volunteers；t1，P1：HG-Tvs. NG-T；t2，P2：HG-Tvs. DM；t3，P3：NG-Tvs. N；t4，P4：DMvs. N；t5，P5：HG-Tvs. N

表3 不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Table 3 Correlation of the expressions of genes associated with colorectal cancer and clinicopathological parameters in colorectal cancer patients with different blood glucose levels

不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者、糖尿病及健康志愿者血清樣本相關(guān)基因mRNA表達(dá)的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)受試者ROC曲線見圖1，最大正確指數(shù)對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)量見表4。根據(jù)ROC曲線及AUC統(tǒng)計(jì)結(jié)果，NOX1、CEACAM5、HDAC1的AUC分別為0.931(P=0.000)、0.852(P=0.000)、0.860(P=0.000)。以診斷臨界點(diǎn)作為判斷依據(jù)計(jì)算4格表數(shù)值(表5)。診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，NOX1、HDAC1在高血糖結(jié)直腸癌患者血清表達(dá)的特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值均在90%以上(表6)。通過平行試驗(yàn)、序列試驗(yàn)評(píng)價(jià)多個(gè)基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)NOX1、CEACAM5、HDAC1對(duì)于高血糖結(jié)直腸癌患者的診斷效能分別具有更高的靈敏度(98.82%)和特異度(99.93%)(表7)。

ROC：受試者工作特性

ROC：receiver operating characteristic

圖1高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌患者血清樣本相關(guān)基因表達(dá)的ROC曲線

Fig1ROC curves of the expressions of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia

表4 高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因表達(dá)的ROC曲線下面積統(tǒng)計(jì)及診斷臨界點(diǎn)Table 4 Area under ROC curves and cut-off values of the exressions of genes associated with colorectal cancer in colorectal cancer patients with hyperglycemia

表6 高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌血清樣本相關(guān)基因表達(dá)的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)Table 6 Diagnostic test of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia

討 論

本研究組前期研究顯示結(jié)直腸癌患者中伴發(fā)高血糖者占29.67%，其中伴發(fā)糖尿病者占14.83%[6]。本研究顯示，109例結(jié)直腸癌患者中血糖正常者占結(jié)直腸癌患者總數(shù)的68.80%，高血糖狀態(tài)者占31.19%，其中并發(fā)糖尿病者占16.51%，本研究結(jié)果與前期報(bào)道基本一致。

筆者前期通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及信息學(xué)分析篩選了5種基因(GRP78、NOX1、CEACAM5、HSP60、HDAC1)，本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR法在不同血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌組織及血液樣本中驗(yàn)證上述基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上述基因mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者空腹血糖狀態(tài)均呈顯著正相關(guān)，可能與結(jié)直腸癌患者的糖代謝異常存在關(guān)聯(lián)。

表7 高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌血清樣本相關(guān)基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)(%)Table 7 Diagnostic test of combined detection of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia(%)

GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克蛋白70家族的成員之一，作為一種分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與鈣穩(wěn)態(tài)及線粒體代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7-10]。GRP78在多種腫瘤組織中高表達(dá)[7-8]，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移10]。本研究顯示GRP78表達(dá)可區(qū)分正常腸組織與結(jié)直腸癌組織，但并不能區(qū)分不同血糖狀態(tài)的結(jié)直腸癌組織，不適宜作為高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌相關(guān)基因。本研究顯示GRP78 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌血管累及呈顯著正相關(guān)，GRP78可能參與了腫瘤細(xì)胞血管侵犯或血道轉(zhuǎn)移過程。有報(bào)道GRP78促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的作用可能與其第648位蘇氨酸糖基化有關(guān)[10]。

NOX1是NADPH 氧化酶家族成員之一，是調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵酶，參與介導(dǎo)糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化等病理損害[11]。本研究顯示NOX1 mRNA在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌樣本中表達(dá)的特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值均在90%以上，可作為高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌候選相關(guān)基因。筆者還發(fā)現(xiàn)NOX1表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤直徑呈顯著正相關(guān)，NOX1可能參與了結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖過程，其機(jī)制可能與作為癌基因c-Myb的下游靶基因有關(guān)，NOX1及c-Myb均在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達(dá)[12]。

CEACAM5是人類組織和腫瘤細(xì)胞分化及增殖的重要調(diào)節(jié)分子，可作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移早期復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)標(biāo)志[13]，并在2型糖尿病血清中顯著高表達(dá)[14]。本研究顯示CEACAM5在結(jié)直腸癌樣本中高表達(dá)，但在不同血糖狀態(tài)腫瘤樣本中的表達(dá)無差異，其mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌血管累及、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度、TNM分期均呈顯著正相關(guān)，CEACAM5與結(jié)直腸癌病程進(jìn)展密切相關(guān)。

HSP60是一種主要存在于線粒體的伴侶蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡，可通過促進(jìn)免疫炎癥、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成參與糖尿病發(fā)生[15]，并與缺氧誘導(dǎo)因子2α存在蛋白相互作用[16]。本研究顯示HSP60在不同血糖狀態(tài)的結(jié)直腸癌樣本中的表達(dá)無差異，其mRNA表達(dá)量隨結(jié)直腸癌患者年齡增大而增高，可能與其參與多種慢性疾病的病理過程有關(guān)。

HDAC1是一類蛋白酶，參與調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)修飾、基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡過程，在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，下調(diào)HDAC1可抑制蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[17]。本研究顯示HDAC1 mRNA在高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌樣本中表達(dá)的特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值均在90%以上，可作為高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌候選相關(guān)基因。本研究還顯示HDAC1 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)病部位、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度、TNM分期均呈顯著正相關(guān)，與高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌的病程進(jìn)展具有密切關(guān)聯(lián)。研究顯示HDAC1與磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)[18]，HDAC1可能通過磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝。目前組蛋白去乙?；敢种苿┮殉蔀槟[瘤藥物研究熱點(diǎn)[19]，開發(fā)針對(duì)HDAC亞型的特異性組蛋白去乙?；敢种苿┎⒚鞔_其作用靶點(diǎn)將成為新的研究方向。

目前臨床上常采用臨床表現(xiàn)、家族史、影像學(xué)、結(jié)腸鏡檢查及血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行結(jié)直腸癌的早期篩查[24-25]。但臨床癥狀典型、影像學(xué)或內(nèi)鏡檢查陽性者其腫瘤大多已發(fā)展到一定階段，已失去最佳治療時(shí)機(jī)；而癌胚抗原及糖蛋白抗原19-9等常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物并不具備較高的組織特異性和診斷準(zhǔn)確性；單個(gè)分子標(biāo)志物的診斷靈敏度、特異性較低，容易造成漏診或誤診。篩選出更高靈敏度、特異度的聯(lián)合檢測(cè)分子標(biāo)志譜是腫瘤分子診斷的研究方向。本研究通過平行試驗(yàn)、序列試驗(yàn)評(píng)價(jià)多個(gè)基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)NOX1、CEACAM5、HDAC1對(duì)于高血糖結(jié)直腸癌患者的診斷效能分別具有更高的靈敏度(98.82%)和特異度(99.93%)。筆者建議在高血糖人群中加大結(jié)直腸癌的早期篩查力度，通過定期聯(lián)合檢測(cè)NOX1、CEACAM5、HDAC1的表達(dá)，密切監(jiān)控其表達(dá)變化與診斷臨界點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)合其他早期診斷方法綜合評(píng)價(jià)高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，為高血糖狀態(tài)結(jié)直腸癌的早診、早治提供參考依據(jù)。

綜上，本研究為合并糖代謝異常等高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤亞型的診療提供了一種新思路，筆者將在表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域開展深入研究，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤亞型的高特異度、高靈敏度的標(biāo)志分子，探討其關(guān)鍵調(diào)控分子的作用機(jī)制，為構(gòu)建個(gè)體化、精準(zhǔn)化腫瘤防治策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。