電場對體外培養(yǎng)軟骨細胞的影響

劉小利 袁小燕

（長治醫(yī)學院物理教研室，山西 長治 046000）

軟骨是一種具有豐富的細胞外基質(zhì)（ECM）的無血管組織，包含少量的軟骨細胞，軟骨細胞可保持ECM的完整性。軟骨組織受到損傷后，軟骨修復主要依賴于軟骨細胞的增殖、分化和ECM合成。如果在常規(guī)條件下體外培養(yǎng)軟骨細胞，由于增殖能力較低，軟骨細胞在經(jīng)過一定的倍增后會逐漸喪失增殖能力而停止分裂。研究表明，軟骨細胞受到電刺激會影響細胞增殖，遷移和基因表達。但施加外電場時所需的電壓、頻率、波形等物理參數(shù)以及電場對軟骨細胞的作用機制仍需進一步探討。

1 電刺激裝置

電刺激場為直流電場或交流電場，可以是脈沖或連續(xù)形式的正弦波、鋸齒波或方波信號。這些信號可以由刺激芯片、信號發(fā)生器或其他儀器產(chǎn)生。電刺激方式為直接刺激或間接刺激。一般情況下，直接刺激是將正負電極直接插入培養(yǎng)皿中刺激細胞。間接刺激是以非侵入性的方式使用連接電源的外部平行電極，即在平行電極之間的培養(yǎng)基上施加電場，是一個電容耦合刺激系統(tǒng)[1]。

2 電場對軟骨細胞的影響

電場在體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞中的應用已表明電場刺激可增加軟骨細胞數(shù)量并刺激合成復合軟骨的主要分子，如Ⅱ型膠原、糖胺聚糖（GAGs）和聚集蛋白聚糖。但是，促進軟骨細胞增值和相關分子的基因表達，需要設置合適的電刺激參數(shù)，如刺激時長、電壓、占空比和頻率。

2.1 直流電場對軟骨細胞的影響：有研究認為，5 μA的直流電可刺激間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化，并增強軟骨細胞的增殖[2]。直流電場還可影響軟骨細胞的遷移[3]，將直流電場作用于牛關節(jié)軟骨細胞，電場強度大于0.8 V/cm時軟骨細胞有陰極遷移反應，當電場強度大于4 V/cm時，軟骨細胞表現(xiàn)出劑量依賴性的陰極遷移。但是，并不是所有的研究都認為直流電場會對軟骨細胞產(chǎn)生影響。Akanji等[4]將分離出的牛關節(jié)軟骨細胞，接種于瓊脂糖結構上，然后暴露在電流密度為4 mA/cm2的直流電場下6小時，結果表明，電流對蛋白質(zhì)合成、細胞增殖、聚集蛋白聚糖和II型膠原mRNA表達無影響。雖然直流電場是提供電刺激的最簡單方法，但是由于金屬電極的生物相容性較差，在電刺激細胞過程中會導致培養(yǎng)基pH值的變化、分子氧水平降低等不良反應，使得這種方法的使用受到了阻礙[5]，目前應用較多的電刺激方式為電容耦合電場。

2.2 電容耦合電場對軟骨細胞的影響：早在1978年就有研究發(fā)現(xiàn)電容耦合電場可促進雞脛骨軟骨細胞DNA合成[6]。隨后，Brighton等[7]做了較詳細的研究，在頻率60 kHz的正弦波條件下，用不同電壓刺激牛膝關節(jié)軟骨細胞24 h，結果表明，10 V和1000 V的電壓抑制了細胞的增殖，而250 V的電壓則增加了GAGs的合成，但電場對關節(jié)軟骨軟骨細胞的作用機制尚不清楚。在以上的研究中，并沒有指明電刺激時電場強度的大小，Armstrong和Brighton 進行了相關的研究。Armstrong[8]使用60 kHz的正弦波信號刺激牛生長板軟骨細胞24 h，當電壓為500、750、1000 V即電場強度為（1.5～3.0）×10-2 V/cm時，細胞增殖顯著；而電壓為1500 V即電場強度為4.5×10-2 V/cm時，電場則明顯抑制了軟骨細胞增殖。Brighton[9]用不同的電場刺激牛生長板軟骨細胞，結果表明，當電場強度分別為15、22.5、30 mV/cm時，軟骨細胞數(shù)量增加；當電場為45 mV/cm，刺激后GAGs合成增加66%，從而可以認為電場強度接近20 mV/cm時，電刺激可促進軟骨細胞增值。在接下來的研究中進一步表明[10]，60 kHz正弦波、強度20 mV/cm的電場可使牛生長板軟骨細胞增殖增加47%。Wang等[11]在更詳細的研究中表明，20 mV/cm的電場在促進軟骨細胞增值的同時，還可促進聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成，但二者所需的最佳電刺激參數(shù)（如占空比和刺激時長）并不相同，說明在不同的電刺激條件下，軟骨細胞中大分子的基因表達上調(diào)具有一定的選擇性。然而，并不能認為只有60 kHz、20 mV/cm的正弦波信號可促進軟骨細胞增值，Vaca-González等[12]用有限元方法分析計算電刺激系統(tǒng)中的電場強度，結果表明，在30 min內(nèi)施加4 mV/cm的電場時細胞數(shù)量增加；在5 h內(nèi)施加8 mV/cm的電場可維持穩(wěn)定的GAGs合成。有研究發(fā)現(xiàn)脈沖電場（PEF）和交變電場也可對軟骨細胞產(chǎn)生影響。使用0.2 mV/cm的電容耦合脈沖電場刺激正常人軟骨細胞，軟骨細胞DNA含量在電刺激后72 h增加近150%[13]。用1 kHz，700 mV的交變電場刺激人膝關節(jié)軟骨細胞，基因表達分析表明，在低氧培養(yǎng)條件下，電場能增加人軟骨細胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達；暴露于缺氧電場后，II型膠原合成顯著增加[14]。

3 電場對軟骨細胞的影響機制

在電場作用于軟骨細胞的過程中，電信號影響軟骨細胞的具體機制仍不清楚[15]，可能涉及鈣信號轉導通路。

Rodan等[6]認為雞脛骨軟骨細胞增殖是由于細胞膜去極化引起的，外加電場促進了軟骨細胞的Na+和Ca2+流通進而觸發(fā)了軟骨細胞的DNA合成。而Beit-Or等[16]在測定體外培養(yǎng)的雞骺軟骨細胞增殖分化的實驗中證實，在軟骨細胞老化過程中細胞內(nèi)游離Ca2+含量逐漸下降，認為Ca2+濃度升高可導致軟骨細胞增殖。最早關于電壓依賴性鈣通道可能參與早期軟骨分化的研究發(fā)表于1989年[17]，其中L型鈣通道是細胞外Ca2+進入細胞的主要途徑，對維持細胞形態(tài)和生理活性起著重要作用。超微結構研究證實了小鼠肢芽軟骨細胞中存在L型鈣通道[18]，Mancilla等[19]的研究也表明L型鈣通道存在于軟骨細胞中，并參與了軟骨細胞的增殖和分化。然而，Sanchez等[20]發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)Ca2+變化不受L型鈣通道阻滯劑（包括維拉帕米）的影響。為了進一步闡明L型鈣通道在軟骨細胞中的作用，Xu等[21]用電容耦合的方式刺激牛髕骨關節(jié)軟骨細胞，結果表明電刺激軟骨細胞主要對細胞膜施加影響，通過激活細胞膜中的電壓依賴性鈣通道，提高細胞內(nèi)Ca2+濃度，導致細胞增殖增強、聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA表達上調(diào)，并對下游的鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)磷酸酶產(chǎn)生影響。

4 結 語

對于電刺激軟骨細胞，不同的研究者使用的電場頻率、強度、刺激時間等參數(shù)各不相同，由于產(chǎn)生電場所需的電壓、達到最佳增殖速率和分子合成的刺激時間以及細胞培養(yǎng)所需的時間等限制因素，所得到的結果存在許多差異。電刺激軟骨細胞的確切作用機制也待進一步闡明。因此，軟骨細胞電刺激在組織工程領域仍然需要更加深入的研究。