解析植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理及克服方法

薛 棪

（荊楚理工學(xué)院，湖北 荊門 448000）

引言

褐變現(xiàn)象對(duì)植物的生長(zhǎng)具有極大危害，是植物組織培養(yǎng)實(shí)踐中的重難點(diǎn)問(wèn)題。據(jù)此，為了提升植物組織培養(yǎng)的順利運(yùn)行，降低植物體因褐變現(xiàn)象而衰弱或死亡的情況發(fā)生，我們有必要對(duì)植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理與客服方法進(jìn)行討論解析。

1 植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理

植物組織的褐變現(xiàn)象可由產(chǎn)生機(jī)制的差異分為非酶促褐變與酶促褐變兩種。其中，所謂“非酶促褐變”，即沒(méi)有酚類底物的干預(yù)，植物體本身由于缺水、衰老、寒冷等原因而發(fā)生的細(xì)胞死亡，如蘋果因過(guò)度成熟而形成褐變、荔枝因失水pH值持續(xù)上升而形成的褐變等。所謂“酶促褐變”，即在酚類底物的干預(yù)之下，經(jīng)過(guò)酶催化而引發(fā)的褐變，此類褐變現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的幾率較高。從產(chǎn)生機(jī)理來(lái)看，酶促褐變的出現(xiàn)與酶、酚類底物、氧氣三個(gè)要素息息相關(guān)。經(jīng)業(yè)內(nèi)長(zhǎng)期的研究與實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，引起植物組織褐變現(xiàn)象的酶主要有多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶以及過(guò)氧化物酶三種，其中尤以多酚氧化酶最為常見(jiàn)。引起植物組織褐變現(xiàn)象的酚類底物主要有苯基羧酸、苯丙烷衍生物以及黃烷衍生物三種。

若植物組織處在健康的生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，即便其體內(nèi)同時(shí)存在酶、酚類底物與氧氣，通常也不會(huì)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。究其原因，主要是酶與酚類底物分布區(qū)域不同，前者多處在細(xì)胞的液泡中，而酚類底物則處在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中。但植物組織健康的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被打破、細(xì)胞膜出現(xiàn)破損時(shí)，酶與酚類底物便保有了接觸的條件，進(jìn)而在氧氣的催化作用下形成醌，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)脫水、聚合等異常反應(yīng)，最終生成黑褐色的病變物質(zhì)，引發(fā)植物組織的褐變現(xiàn)象。此外，經(jīng)相關(guān)學(xué)者對(duì)金花梨、蒼溪梨等植物的研究發(fā)現(xiàn)，褐變現(xiàn)象的出現(xiàn)幾率、發(fā)生程度存在一定規(guī)律性，與酶的活性和酚類底物的含量相關(guān)[2]。

2 植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象產(chǎn)生的影響因素

2.1 植物本身的影響

第一，植物的類別及品種的影響。與草本植物相比，木本植物更容易發(fā)生褐變現(xiàn)象。經(jīng)周俊輝等學(xué)者的專項(xiàng)研究表明，寬皮桔、東北紅豆杉、牡丹、荔枝、蘋果、銀杏、獼猴桃等木本植物的褐變現(xiàn)象較為普遍。木本植物之所以更容易發(fā)生褐變現(xiàn)象，主要是因?yàn)槠浼?xì)胞中木質(zhì)素、單寧等酚類底物的含量較高。此外，在進(jìn)行柑橘屬木本植物的培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，寬皮桔的褐變現(xiàn)象最為嚴(yán)重，葡萄柚、橘橙辭職，甜橙的褐變程度相對(duì)較輕。由此可見(jiàn)，在同一類別之下，不同品種植物的褐變程度存在很大不同。究其原因，應(yīng)是受到不同品種植物細(xì)胞組織中酚含量的差異影響。

第二，植物體積及破壞程度的影響。通常來(lái)講，植物的體積越小，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)越密集，褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率也就越大。反之，植物的體積越大，其細(xì)胞破壞后酶與酚類底物越難接觸，褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率也就越小。同時(shí)，經(jīng)實(shí)踐研究表明，培養(yǎng)中植物體的切口面積也會(huì)對(duì)褐變現(xiàn)象產(chǎn)生影響。例如，當(dāng)金冠蘋果的切削口徑處在0.5毫米以下時(shí)，其褐變現(xiàn)象最為嚴(yán)重，且較已易引起蘋果的局部失活或整體死亡；當(dāng)金冠蘋果的切削口徑處在5毫米至15毫米的區(qū)間內(nèi)時(shí)，其褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率最低，且褐變后的死亡率也降至10%左右。但從既往經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，這一規(guī)律并不是普適的。例如，桉樹(shù)葉片的切削面積越大，其酚類底物的產(chǎn)生數(shù)量越多，褐變現(xiàn)象也就越嚴(yán)重。

第三，植物生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。通常情況下，酶與酚類底物兩大褐變要素會(huì)隨著植物體的生理變化而變化，當(dāng)植物年齡增長(zhǎng)、木質(zhì)化加劇時(shí)，其內(nèi)部的酶與酚類底物含量也會(huì)隨之升高。因此，幼齡期植物的褐變程度往往最輕，這一點(diǎn)也在山核桃、桉樹(shù)等植物的培養(yǎng)研究中得到了有力證實(shí)。同時(shí)，相關(guān)人員在采集培養(yǎng)所需的植物材料時(shí)，所選時(shí)節(jié)的不同也會(huì)影響到植物后續(xù)的褐變程度。一般來(lái)講，夏季的環(huán)境氣溫較高、光照充足，植物的代謝活動(dòng)旺盛、光合作用較強(qiáng)，其細(xì)胞中酶的活性也有所升高。若在此時(shí)采集植物材料，褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率將顯著增加。相比之下，秋冬季節(jié)的氣溫較低，空氣也相對(duì)干燥，因此植物大多代謝緩慢，甚至處在半休眠的狀態(tài)當(dāng)中。若相關(guān)人員選擇此時(shí)作為植物材料的采集時(shí)期，由于植物細(xì)胞中酶的活性較低，褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率也會(huì)隨之減小。

2.2 植物處理方式的影響

在正式進(jìn)行植物組織的培養(yǎng)之前，相關(guān)人員還需對(duì)植物體進(jìn)行水培、消毒等預(yù)處理手段，也會(huì)對(duì)植物后續(xù)的褐變幾率產(chǎn)生影響。通常來(lái)講，植物的水培時(shí)間越長(zhǎng)，其褐變幾率越低。同時(shí)，先采用流動(dòng)水沖洗植物，再進(jìn)行5℃左右的低溫處理，從而降低植物細(xì)胞的活性，也能達(dá)到降低褐變幾率的預(yù)處理效果。此外，相關(guān)人員在對(duì)植物材料進(jìn)行消毒時(shí)，也應(yīng)遵循科學(xué)適度的處理原則。一方面，氯化汞對(duì)植物體的傷害較輕，褐變幾率也較低；乙醇的滅菌效果較強(qiáng)，但對(duì)植物體的傷害較大，褐變現(xiàn)象也較容易發(fā)生。因此，相關(guān)人員應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)需求，實(shí)施出正確的消毒劑選擇策略。另一方面，植物的消毒時(shí)間越長(zhǎng)，其褐變的發(fā)生幾率也越高。所以，相關(guān)人員還應(yīng)對(duì)消毒處理的時(shí)間進(jìn)行合理控制，以確保植物的健康生長(zhǎng)。

2.3 植物培養(yǎng)環(huán)境的影響

培養(yǎng)基作為植物培養(yǎng)生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)，其基質(zhì)種類、營(yíng)養(yǎng)成分的不同也會(huì)對(duì)植物褐變現(xiàn)象產(chǎn)生差異影響。當(dāng)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高時(shí)，植物體內(nèi)的酚類底物會(huì)從細(xì)胞間質(zhì)中溢出，繼而與酶充分接觸，引發(fā)褐變現(xiàn)象。因此，通過(guò)降低培養(yǎng)基中亞鐵離子、亞銅離子等離子的濃度，能有效防止酚類底物的外溢，避免酚類底物與酶接觸發(fā)生氧化，從而將褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率控制在較低水平。同時(shí)，不同植物種類對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)能力也各不相同。經(jīng)研究顯示，核桃、櫻花、蘋果等植物在1/2MS與1/2DKW兩種培養(yǎng)基中的褐變控制效果最好，銀杏、紅豆杉等植物在MS培養(yǎng)基中的褐變控制效果最好。

其次，在植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，做好基質(zhì)的選擇也是極有必要的。從褐變現(xiàn)象的預(yù)防角度來(lái)看，紙橋法為最佳，液體培養(yǎng)法次之，半固體培養(yǎng)法再次，固體基質(zhì)的預(yù)防效果最差。究其原因，主要是紙橋法的濾紙結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)毒害物質(zhì)的滲透吸取，進(jìn)而達(dá)到清潔培養(yǎng)環(huán)境、減輕褐變危害的效果；液體基質(zhì)可實(shí)現(xiàn)毒害物質(zhì)的外化擴(kuò)散，從而緩解褐變現(xiàn)象的集中形成，也能達(dá)成較好的褐變減輕目的；半固體基質(zhì)多以低濃度的瓊脂為主，其雖然也能保有類似液體基質(zhì)的毒害物質(zhì)擴(kuò)散能力，但由于動(dòng)性較差，褐變減輕效果并不理想；固體基質(zhì)則無(wú)法完成毒害物質(zhì)由植物體向外部環(huán)境的有效導(dǎo)出，因此很難對(duì)褐變現(xiàn)象起到控制作用。

最后，上文提到，季節(jié)變化可對(duì)植物體內(nèi)酶的活性產(chǎn)生影響，控制植物組織培養(yǎng)環(huán)境的溫度也可達(dá)到此類效果。一般來(lái)說(shuō)，溫度處在較低水平時(shí)，褐變現(xiàn)象能得到顯著減輕。例如，當(dāng)板栗的培育溫度降至19℃時(shí)，其褐變程度明顯緩解；當(dāng)無(wú)花果的培育溫度降至10℃時(shí)，其褐變幾率最低。因此，相關(guān)人員在不影響植物健康生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，可進(jìn)行培養(yǎng)環(huán)境溫度的適當(dāng)調(diào)低。與之相似，經(jīng)桉樹(shù)外植體全光照與無(wú)光照的比對(duì)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10個(gè)試驗(yàn)日內(nèi)全光照下的桉樹(shù)褐變幾率明顯增高，而無(wú)光照下的桉樹(shù)則正相反。由此可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)光照條件、適當(dāng)抑制植物的光合作用，也能起到減緩植物代謝、降低褐變幾率的效果。因此，相關(guān)人員在植物組織培養(yǎng)的實(shí)踐當(dāng)中，也可適當(dāng)應(yīng)用暗處理的褐變預(yù)防手段。

3 植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的克服方法

3.1 做好植物材料的科學(xué)選擇

上文提到，植物材料的成長(zhǎng)狀態(tài)、采集時(shí)間都會(huì)對(duì)褐變現(xiàn)象的發(fā)生幾率產(chǎn)生影響。因此，相關(guān)人員在選擇和采集外植體進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量選擇幼齡期的植株，并將采集時(shí)間避開(kāi)夏季。同時(shí)，基于自然生長(zhǎng)規(guī)律，植物在冬天往往處在深度休眠當(dāng)中，生長(zhǎng)能力較弱，故而存在較大的采集難度。所以，在早春或深秋進(jìn)行外植體采集為宜。除此之外，由于同一類型下不同品種植物的褐變程度也有所差異，因此相關(guān)人員在采集時(shí)還應(yīng)注意植物的基因特點(diǎn)，選擇出褐變程度較小、褐變幾率較低的植物品種作為外植體。

3.2 實(shí)施合理的植物預(yù)處理手段

酶與酚類底物在氧的催化作用下生成醌，這類物質(zhì)是植物體發(fā)生褐變現(xiàn)象的毒害元兇。在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，相關(guān)人員可通過(guò)科學(xué)的預(yù)處理手法，降低醌類物質(zhì)的毒害作用與生成能力。首先，應(yīng)將外植體進(jìn)行流水沖洗，再將其置于2℃至5℃的環(huán)境中低溫處理12小時(shí)至24小時(shí)，從而減緩植物的代謝，降低細(xì)胞內(nèi)酶的活性。其后，再應(yīng)用氯化汞或70%濃度的乙醇對(duì)外植體進(jìn)行消毒，將其接種在僅含蔗糖的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天至7天，以便將植物組織中的酚類底物滲透到瓊脂當(dāng)中。若一周后仍有酚類底物滲出，則還需進(jìn)行2至3次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。最后，當(dāng)酚類物質(zhì)顯著減少時(shí)，便可將外植體接種到適宜的培養(yǎng)基當(dāng)中。這樣一來(lái)，在促進(jìn)外植體切口愈合的同時(shí)，能達(dá)到理想的褐變現(xiàn)象減輕目的[2]。

3.3 優(yōu)化植物培養(yǎng)的環(huán)境條件

首先，應(yīng)基于植物組織培養(yǎng)的技術(shù)條件，按照紙橋培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)的次序選擇培養(yǎng)基質(zhì)，并結(jié)合外植體品種對(duì)培養(yǎng)基的MS、WPM、B5等具體類型進(jìn)行科學(xué)選擇，控制好培養(yǎng)基中蔗糖、無(wú)機(jī)鹽、離子的成分濃度。其次，由于溫度會(huì)對(duì)植物的褐變程度與褐變幾率產(chǎn)生影響，所以相關(guān)人員應(yīng)保證培養(yǎng)環(huán)境溫度不宜過(guò)高。最后，在外植體的培養(yǎng)初期，可在無(wú)光照或弱光照的暗處理?xiàng)l件下進(jìn)行，以便降低植物細(xì)胞中酶的活性，有效規(guī)避褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生。

3.4 在培養(yǎng)基質(zhì)中適當(dāng)添加抗褐變劑

當(dāng)合理實(shí)施上述措施后，仍然無(wú)法達(dá)成高水平的褐變現(xiàn)象客服效果時(shí)，相關(guān)人員而通過(guò)添加抗褐變劑的方式，對(duì)植物組織培養(yǎng)條件進(jìn)行人工改良。從當(dāng)前來(lái)看，業(yè)內(nèi)常用的抗褐變劑主要有吸附劑、抗氧化劑兩類。其中，吸附劑主要以活性炭為主，可在氫鍵與分子的相互作用下實(shí)現(xiàn)周圍物質(zhì)的有效吸附。但需要注意的是，由于活性炭的吸附缺乏選擇性，其在吸附毒害物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而與外植體形成一定的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。對(duì)此，相關(guān)人員在應(yīng)用活性炭時(shí)，可適當(dāng)提高培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，以便保證植株的健康生長(zhǎng)。據(jù)有關(guān)研究顯示，在應(yīng)用活性炭后，植物褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生幾率可降低22%左右。抗氧化劑有檸檬酸、硝酸銀、植酸、二硫蘇糖醇等多種類型，可對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)酚類底物的氧化效應(yīng)形成抑制作用，從而降低醌類毒害物質(zhì)的生成，達(dá)到阻抗褐變現(xiàn)象的效果。需要注意的是，不同類型、不同濃度的氧化劑對(duì)不同植物材料的作用能力也存在一定差異。例如，對(duì)于葡萄的愈傷組織來(lái)說(shuō)，濃度為20克每升的甘露醇溶液應(yīng)用效果最好，濃度為0.02克每升的硝酸銀溶液次之；對(duì)于牡丹來(lái)說(shuō)，濃度為2.0毫克每升的硝酸銀溶液應(yīng)用效果最好。

4 總結(jié)

總而言之，結(jié)合業(yè)內(nèi)研究成果與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物褐變現(xiàn)象產(chǎn)生的影響因素比較多樣復(fù)雜。因此，相關(guān)人員在植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，也應(yīng)從植物品種、培養(yǎng)環(huán)境、預(yù)處理等多個(gè)角度入手進(jìn)行優(yōu)化，以便實(shí)現(xiàn)植物褐變幾率的有效降低。