CD163 與豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展

李樹(shù)斌 張雅璇 王春雨 任敬宇 戴雁峰

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010021）

1987—1996 年，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV） 感染、侵襲引發(fā)的豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS，又稱豬藍(lán)耳病）在美國(guó)全面暴發(fā)，隨后該疾病陸續(xù)傳播至北美、歐洲等各個(gè)國(guó)家和地區(qū)，妊娠母豬感染該病后表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)率顯著增加36.4%，死胎率顯著增加6.6%，而新生仔豬存活率降低6.7%，哺乳期仔豬的存活率減少30.7%，同時(shí)，仔豬肺炎嚴(yán)重，生長(zhǎng)速度劇烈下降[1]。

從1996 年我國(guó)發(fā)現(xiàn)首例豬藍(lán)耳病開(kāi)始，至今已有30 余年，藍(lán)耳病反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重阻滯了我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來(lái)我國(guó)出現(xiàn)的高致病性豬藍(lán)耳病進(jìn)一步對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了致命打擊，而且我國(guó)的養(yǎng)豬企業(yè)存在豬群密集、流動(dòng)頻繁等情況，進(jìn)一步擴(kuò)大了感染范圍，由于目前商業(yè)化的疫苗只能提供部分保護(hù)，因此藍(lán)耳病的迅速傳播嚴(yán)重?fù)p害了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，基于PRRSV 入侵機(jī)體的機(jī)理研發(fā)對(duì)應(yīng)的抗體，提升我國(guó)生豬對(duì)PRRSV 的抵抗力對(duì)保障我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

1 PRRSV 結(jié)構(gòu)及其感染過(guò)程

1.1 PRRSV 及基因組結(jié)構(gòu)

PRRSV 與馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus,EAV）、小鼠乳酸脫氫酶病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV）以及猴出血熱病毒（Simian hemorrhagic fever virus,SHFV）等病毒均隸屬于尼多病毒目（Nidovirales）動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬的主要成員。在電子顯微鏡下觀測(cè)，PRRSV 的直徑為50～60 nm，呈球形或橢圓形顆粒，具有相對(duì)光滑的外觀，PRRSV 的核衣殼直徑為25～35 nm，呈20 面立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，具有電子致密性，同時(shí)，核衣殼表面有約5 nm 的突起結(jié)構(gòu)，其外圍被一層脂質(zhì)雙層膜圍繞[2]。

作為不分節(jié)段的單股、正鏈RNA 病毒，PRRSV 的基因組RNA 長(zhǎng)度約為15 kb，在其5’端處存在帽子結(jié)構(gòu)（5’-Cap），而3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾巴結(jié)構(gòu)（3’-polyA），目前的研究報(bào)道指出，在病毒復(fù)制過(guò)程中，3’端的結(jié)構(gòu)域可能是RNA 聚合酶結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域之一。

PRRSV 基因組結(jié)構(gòu)中含有9 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORFs）， 分 別 為 ORF1a、 ORF1b、ORF2a、 ORF2b、 ORF3、 ORF4、 ORF5、 ORF6 及ORF7，以上每個(gè)閱讀框之間都與其相鄰的閱讀框之間存在部分的堿基重疊區(qū)域，重疊序列結(jié)構(gòu)為5’-ORF1a和ORF1b-ORF(2-6)ORF7-3’端。

ORF1（ORF1a 與ORF1b 之間存在16 個(gè)重疊的核苷酸） 長(zhǎng)度約為12 kb，占整個(gè)基因組全長(zhǎng)的80%。ORF1 閱讀框位于PRRSV 基因組5’端的非編碼前導(dǎo)序列（211 個(gè)堿基）之后，其主要功能是編碼部分高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白以及RNA 聚合酶或合成酶等蛋白，在ORF1a 編碼區(qū)中存在絲氨酸蛋白酶區(qū)和富含半胱氨酸區(qū)的疏水區(qū)域，而ORF1b 的序列中存在4 個(gè)特異區(qū)域，即聚合酶元序列區(qū)域、蝸牛酶元序列區(qū)域、富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指區(qū)域及目前功能尚未明確的保守區(qū)域。在ORF1a 和ORF1b 的重疊區(qū)存在7 個(gè)核苷酸結(jié)構(gòu)（UUUAAAC）和形成RNA 擬節(jié)序列，這2 種序列（結(jié)構(gòu)）進(jìn)一步參與調(diào)控RNA 聚合酶翻譯過(guò)程中的核糖體移碼。

ORF2～ORF7 分布在PRRSV 基因組的約3.5 kb 3’端，ORF7 終止密碼子后為114 個(gè)堿基的非編碼區(qū)和僅20 個(gè)堿基的3’-poly（A）尾巴序列。ORF2～ORF7 主要的生物學(xué)功能是負(fù)責(zé)編碼病毒中的結(jié)構(gòu)蛋白，如囊膜糖蛋白（如GP5 蛋白）、基質(zhì)蛋白（M 蛋白）及核衣殼蛋白（N 蛋白）等。由ORF6 編碼的M 蛋白和由ORF7編碼的N 蛋白為PRRSV 結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)蛋白，其氨基酸序列相對(duì)保守，目前已被用于疾病診斷的靶抗原[2-4]。

1.2 PRRSV 分型

根據(jù)PRRSV 的抗原性、基因組及致病性等特性，目前可將PRRSV 分為2 個(gè)主要亞型，即歐洲型（主要以LV 株為代表株）和美洲型（主要以ATCC-VR2332株為代表株）[5,6]，基因組學(xué)和遺傳學(xué)相關(guān)研究結(jié)果表明，PRRSV 在RNA 合成過(guò)程中極易發(fā)生RNA 基因組的點(diǎn)突變、堿基缺失、添加和取代等過(guò)程，從而導(dǎo)致PRRSV的突變頻率極高，而且大量針對(duì)不同地區(qū)PRRSV 的序列分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PRRSV 歐洲型和美洲型之間的確存在極大的序列差異性，其核苷酸的同源性僅為55%～70%。

PRRSV 的歐洲型與美洲型毒株中5’UTR 和3’UTR 的序列差異非常顯著，其同源性顯著低于50%。在歐洲型毒株的5’UTR 結(jié)構(gòu)域中存在221～223 個(gè)核苷酸，而在美洲型毒株中，序列相對(duì)保守的5’UTR 結(jié)構(gòu)域中存在189～190 個(gè)核苷酸，僅存在個(gè)別堿基的置換或缺失情況。與歐洲型毒株相比，美洲型毒株的3’UTR 序列更長(zhǎng)，2 種毒株3’UTR 堿基序列的同源性顯著低于60%，此外，2 種毒株的polyA 數(shù)量間的差異性進(jìn)一步影響了PRRSV 的復(fù)制過(guò)程。

通過(guò)深入分析、比對(duì)歐、美型毒株的序列的差異，結(jié)果表明歐、美型毒株之間，ORF1 序列的差異性較大，而ORF1 序列的差異性主要是由ORFla 序列的差異性所決定，分析原因認(rèn)為，Nsp1β 及Nsp2 等非保守氨基酸的差異性決定了歐、美型毒株之間的差異性。作為歐、美型毒株間變異最大的編碼區(qū)域之一，Nsp2 具有種間特異性，其生物學(xué)功能是參與調(diào)控PRRSV 對(duì)細(xì)胞或組織的嗜性。有研究報(bào)道指出，Nsp2 的活性與PRRSV 毒株的致病性密切相關(guān)。

1.3 PRRSV 感染豬的過(guò)程

在PRRSV 感染豬群的過(guò)程中，該病毒可以通過(guò)環(huán)境應(yīng)激、垂直傳播及水平傳播等途徑進(jìn)入病豬鼻腔中，粘附后破壞鼻腔黏膜組織及纖毛結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步導(dǎo)致纖毛失去其原有生理功能，不能有效地過(guò)濾病毒入侵；隨著PRRSV 入侵咽喉及支氣管腔，病毒進(jìn)一步定植于支氣管腔上皮細(xì)胞處，快速引發(fā)豬咳嗽及大喘氣；隨著感染的深入，PRRSV 進(jìn)一步降低了豬對(duì)支原體等病原的抵抗性，導(dǎo)致了鼻腔內(nèi)纖毛的大量脫落及纖毛上皮細(xì)胞的急性損傷，同時(shí)抑制了纖毛的擺動(dòng)，導(dǎo)致纖毛喪失其甩動(dòng)黏液的功能。

在支原體等抗原的催化作用下，PRRSV 可特異性地與細(xì)胞表面的CD151 分子、CD163 分子、硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）以及波形蛋白（Vimentin）等受體進(jìn)行特異性結(jié)合，促進(jìn)自身經(jīng)胞吞作用進(jìn)入豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage），并在肺泡巨噬細(xì)胞中快速擴(kuò)增，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞的破裂、溶解以及肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著下降，從而抑制豬肺泡的正常生理功能，并引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。肺泡巨噬細(xì)胞的破裂導(dǎo)致PRRSV 進(jìn)一步隨著血液循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至全身，并進(jìn)一步在血液巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中快速擴(kuò)繁，進(jìn)一步引發(fā)全身性敗血癥狀、淋巴腫大及相應(yīng)肺臟器官損傷等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致豬個(gè)體死亡[4,7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，以上這些受體中CD163 是PRRSV 感染宿主細(xì)胞的必需受體。

2 CD163 與PRRSV 感染的相關(guān)性研究

在機(jī)體的免疫過(guò)程中，巨噬細(xì)胞起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其機(jī)理與成熟的巨噬細(xì)胞和它的前體——單核細(xì)胞密切相關(guān)，上述2 類細(xì)胞在機(jī)體免疫過(guò)程中形成高度特異化的細(xì)胞亞群，密切參與機(jī)體的免疫過(guò)程。巨噬細(xì)胞亞群的生物學(xué)功能主要取決于巨噬細(xì)胞表面的不同特異性受體，如補(bǔ)體受體（Complement receptor）、清道夫受體（scavenger receptor）、Fc 受體（The Fc receptor）、生長(zhǎng)因子、粘附分子和可溶性介質(zhì)受體等。其中，包括了膠原型受體、C 型外源凝集素受體、富含亮氨酸或半胱氨酸重復(fù)序列型受體等成員的清道夫受體家族功能基本相似，但其結(jié)構(gòu)多種多樣，按照其結(jié)構(gòu)特性，可將清道夫受體家族進(jìn)一步依次劃分為8 個(gè)類型（A-H）。

CD163 作為富半胱氨酸清道夫受體（scavenger receptor cysteine-rich domain, SRCR） 超家族的主要成員之一，其I 型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域是PRRSV 感染細(xì)胞必需的結(jié)構(gòu)，而且不同動(dòng)物之間跨膜域的蛋白序列也具有良好的保守性，其生物學(xué)功能與受體分子與細(xì)胞膜的錨定過(guò)程密切相關(guān)。

2.1 CD163 結(jié)構(gòu)和功能

CD163 蛋白的分子量約為130 kDa，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3 部分組成，CD163 的胞外區(qū)是由9 個(gè)重復(fù)的SRCR（scavenger receptor cysteine rich）結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)脯氨酸—絲氨酸—蘇氨酸富集結(jié)構(gòu)域（PST）構(gòu)成的。CD163 中的每個(gè)SRCR 結(jié)構(gòu)域均由100～110 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，需要指出的是除第8 個(gè)SRCR 結(jié)構(gòu)域中存在6 個(gè)半胱氨酸殘基外，其余的SRCR 結(jié)構(gòu)域均只含有8 個(gè)半胱氨酸殘基[10]。

早期研究結(jié)果表明，CD163 可作為有核紅細(xì)胞的附著受體，密切參與調(diào)節(jié)體內(nèi)紅細(xì)胞的生成過(guò)程。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD163 蛋白的巨噬細(xì)胞具有清除血液中血紅素的作用，在該過(guò)程中，CD163 蛋白質(zhì)的第3 個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域暴露于巨噬細(xì)胞表面，在Ca2+和pH 值的調(diào)控下，該結(jié)構(gòu)域可特異性地結(jié)合血紅素—結(jié)合珠蛋白（hemoglobin haptoglobin complex, Hb-Hp）復(fù)合體，隨后將其運(yùn)輸至早期細(xì)胞內(nèi)體中，之后，CD163 迅速脫離復(fù)合體，重新轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，而Hb-Hp 復(fù)合物則在溶酶體中被進(jìn)一步水解。因此，CD163 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用可以快速清除細(xì)胞周圍的Hb-Hp 復(fù)合物，從而使組織或細(xì)胞不受Hb 引發(fā)的氧化損傷等不利情況。另外，CD163與Hb-Hp 復(fù)合物的特異性結(jié)合可進(jìn)一步激活如IL-10、Fe2+、CO 和膽紅素等炎癥相關(guān)因子的釋放。

此外，CD163 在人和小鼠的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面特異性表達(dá)，而且密切參與巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程[11]。CD163 的表達(dá)水平受促炎信號(hào)和抑炎信號(hào)調(diào)控，并在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前在臨床血液和體液中均可檢測(cè)到可溶性CD163（soluble CD163,sCD163）的表達(dá)，這種由CD163 胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的復(fù)合物可在臨床上作為單獨(dú)的生物標(biāo)記物?？扇苄缘腃D163 和跨膜的CD163 分子均具有很強(qiáng)的抗炎癥作用，但只有可溶性的CD163 分子對(duì)T 細(xì)胞的增殖有抑制作用[11]。同時(shí)，CD163 還是PRRSV 和SHFV11 等病毒感染過(guò)程中的關(guān)鍵受體。

2.2 CD163 在PRRSV 入侵過(guò)程中的作用

在豬體內(nèi)，PRRSV 主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophage, PAM）。研究人員在對(duì)PAM 細(xì)胞的cDNA 表達(dá)文庫(kù)篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD163 蛋白后，可以將PRRSV 非易感細(xì)胞系轉(zhuǎn)變?yōu)镻RRSV 易感細(xì)胞系。如在PAM 細(xì)胞系3D4/21（把SV40 的大T 抗原轉(zhuǎn)入已構(gòu)建的永生化細(xì)胞系）中，發(fā)現(xiàn)該永生細(xì)胞系并不能感染PRRSV，并且在這個(gè)細(xì)胞系中并沒(méi)有檢測(cè)到CD163 分子的表達(dá)水平[12]，但在永生化細(xì)胞系中對(duì)CD163 進(jìn)行過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞系容易感染PRRSV，細(xì)胞系中高表達(dá)CD163 后，PRRSV 對(duì)細(xì)胞系的感染能力急劇增加，而且細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的病毒滴度顯著高于MARC-145 細(xì)胞感染PRRSV 后產(chǎn)生的病毒滴度。

同時(shí)，在不能感染PRRSV 的細(xì)胞系（LLC-PK1、PK-0809、BHK-21 和NLFK 細(xì)胞系） 中對(duì)CD163 進(jìn)行過(guò)表達(dá)，可以使這些細(xì)胞系易被PRRSV 感染并產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，而且在自然狀態(tài)下，Dulac 細(xì)胞（PK15 細(xì)胞亞系）和PK15 細(xì)胞均無(wú)法感染PRRSV，但過(guò)表達(dá)CD163 分子后卻能使上述2 種細(xì)胞系易被PRRSV 感染。

Genus Plc 公司和美國(guó)密蘇里大學(xué)在2016 年合作，利用最新的CRISPR-Cas9 技術(shù)培育出了CD163 基因缺失的基因編輯豬，系列攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，CD163 基因缺失豬不能被PRRSV 感染，這個(gè)關(guān)鍵性的成果進(jìn)一步表明CD163 是PRRSV 感染豬宿主必需的受體[13]。

盡管在上述非易感PRRSV 細(xì)胞系中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)CD163 分子能夠使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐赘蠵RRSV 細(xì)胞系，但內(nèi)化的病毒粒子水平極低，而且PRRSV 只在部分細(xì)胞中表現(xiàn)出數(shù)量的上調(diào)[14]，這表明CD163 在PRRSV 的內(nèi)化過(guò)程中并不是起著關(guān)鍵的作用。將抗CD163 的單克隆抗體與PAM 細(xì)胞系一起在37℃下孵育，發(fā)現(xiàn)PAM 細(xì)胞中的PRRSV 感染水平被顯著性抑制，但在4℃條件下用同樣的抗體和細(xì)胞進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)PAM 細(xì)胞中PRRSV的感染水平無(wú)顯著變化，上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CD163 在調(diào)控PRRSV 的感染過(guò)程中，主要參與的是病毒內(nèi)吞和脫殼，而非吸附或內(nèi)化過(guò)程。

3 小結(jié)

綜上所述，CD163 在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面特異性表達(dá)，是PRRSV 入侵細(xì)胞時(shí)的必需受體，該分子既可以結(jié)合PRRSV 顆粒，還密切參與調(diào)控病毒RNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過(guò)程[15]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在PRRSV 感染宿主細(xì)胞及豬發(fā)病的過(guò)程中，CD163 不僅能促進(jìn)病毒的內(nèi)吞及外殼的脫落，還在基因組RNA 釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，因此，進(jìn)一步了解PRRSV 與CD163 的特征及關(guān)系有助于有效防治豬的PRRS。