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    一例豬繁殖與呼吸綜合征病的診斷

    2019-12-30 04:57:40覃燕靈董建國王艷午
    中國豬業(yè) 2019年8期
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹肺臟核苷酸

    覃燕靈 董建國 王艷午

    (1 廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng), 廣西南寧 530000; 2 信陽農(nóng)林學(xué)院, 河南信陽 464000;3 廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光有限公司, 廣西南寧 530000)

    豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病,又稱藍(lán)耳病。臨床上以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡階段豬只的呼吸道癥狀為主要特征。該病于1987 年在美國暴發(fā)[1],1996 年郭寶清等[2]首次從北京地區(qū)暴發(fā)流行病豬的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到PRRSV,2006 年春夏季首次暴發(fā)由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly-pathogentic PRRSV,HP-PRRSV)引起的“豬無名高熱病癥”給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損害[3-4]。2015 年我國暴發(fā)由NADC30-like 毒株引起的PRRS,再次嚴(yán)重打擊了養(yǎng)豬業(yè)[5-6]。

    PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬,基因組為單股正鏈RNA,基因組全長(zhǎng)約15 kb[7]。由9 個(gè)開放閱讀 框(ORF):ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7 組成[8-9]。ORF5 編碼的GP5 是PRRSV 的膜蛋白。該蛋白是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白,成為PRRSV遺傳變異分析的靶基因[10]。本研究通過對(duì)一例豬場(chǎng)的疑似PRRS 陽性病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷分析,以期為疾病的診斷提供科學(xué)的思路。

    1 材料與方法

    1.1 病料樣品采集

    2018 年3 月,駐馬店地區(qū)某豬場(chǎng)疑似PRRS 的豬,采集豬肺臟組織,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑

    TRIzol 試劑、dNTP Mixture、DL 2 000 Marker、LA Taq DNA 聚合酶、動(dòng)物總RNA 快速提取試劑盒來自生工生物工程(上海)有限公司。

    1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

    參考GenBank 中收錄的PRRS 基因組序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF5 的引物,由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物序列ORF5-F:ACCACCGCAGCATCA GACTTCGTT(5'—3'),下游引物序列:ORF5-R:CGGCCGCGACTTACCTTTAGAGC(5'—3'),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為760 bp,退火溫度為60℃。

    1.4 組織總RNA 的提取和ORF5 基因的擴(kuò)增鑒定

    采集病豬肺臟組織,用剪刀剪碎,加入少量無菌PBS 并用研磨器研磨成汁,12 000 r/min 離心5 min,取上清按照試劑盒操作說明提取病料組織總RNA。取6 μL RNA 模 板、 12.5 μL 2 ×FastKing One Step RT-PCR Master Mix、1 μL 25×RT-PCR Enzyme Mix、上下游引物各1.25 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL 共25 μL 體系,在儀器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:42℃30 min,95℃3 min;94℃30 sec,60℃30 sec,72℃30 sec,35 個(gè)循環(huán);72℃5 min。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    1.5 ORF5 基因序列比對(duì)和進(jìn)化分析

    將鑒定陽性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定,隨后將獲得的序列與PRRSV 代表毒株用DNAStar 進(jìn)行序列比對(duì)并用Mega 進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

    2 結(jié)果

    2.1 臨床病變

    由圖1 可知,病豬肺臟組織出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎病變,且肺臟萎縮實(shí)變,說明豬只肺臟病變嚴(yán)重。

    圖1 病豬肺臟病變圖

    2.2 PCR 鑒定結(jié)果

    將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示擴(kuò)增出PRRSV ORF5 基因片段,片段大小為603 bp,說明引起該病的病原為PRRSV。見圖2。

    圖2 PRRSV ORF5 基因的擴(kuò)增

    2.3 ORF5 基因進(jìn)化樹構(gòu)建

    運(yùn)用軟件MEGA6.0 對(duì)獲得的PRRSV ORF5 基因序列和從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載的23 個(gè)國內(nèi)外參考毒株的ORF5 基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3 可知,駐馬店地區(qū)流行的毒株為美洲型,屬于NADC30-like 毒株。美洲型毒株進(jìn)一步分為4 個(gè)亞群,分別是以VR-2332為代表的lineage5/sublineage 5.1,以NADC30 為代表的lineage1/sublineage1.9,以CH-1a 為代表的subgroup I 和以JXA1 為代表的subgroup III。

    圖3 PRRSV ORF5 進(jìn)化樹的構(gòu)建

    2.4 ORF5 基因序列必對(duì)

    利用DNAStar 中的Megalign 軟件對(duì)擴(kuò)增的ORF5毒株與5 株國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行基因序列同源性分析。由圖4 可知,ZMD 與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%;和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%;與經(jīng)典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%;和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%;與NADC30毒株核苷酸同源性最高,為95.9%。

    圖4 PRRSV GP5 基因序列比對(duì)分析

    3 結(jié)論和討論

    通過臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析可知,引起豬場(chǎng)發(fā)病的是PRRSV NADC30-like 毒株,該毒株于2015年在中國暴發(fā),隨后中國許多地區(qū)均發(fā)現(xiàn)PRRSV 陽性[11]。河南地區(qū)也是發(fā)現(xiàn)PRRSV NADC30-like 毒株陽性較早的地區(qū),該病的發(fā)生給本地區(qū)PRRSV 疫病的防控帶來了嚴(yán)重打擊。

    GP5 蛋白是PRRSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,它在病毒的吸附和入侵過程中發(fā)揮重要作用。GP5 蛋白同時(shí)是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白,為此常作為PRRSV 遺傳進(jìn)化分析的靶基因[10]。ZMD 毒株與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%;和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%,表明ZMD 毒株為美洲型毒株;與經(jīng)典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%;和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%;與NADC30 毒株核苷酸同源性最高,為95.9%,進(jìn)化樹分析顯示ZMD 與NADC30 和NADC30-like 毒株位于同一分支,這些結(jié)果表明ZMD毒株為NADC30 樣毒株。該結(jié)果確證該豬場(chǎng)的疫病是由NADC30 樣毒株感染引起。

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