沙門(mén)氏菌檢測(cè)的研究進(jìn)展

郭耀東，韓曉江，張英華，岳田利

（1.商洛學(xué)院健康管理學(xué)院，陜西商洛 726000；2.商洛市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西商洛 726000；3.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710069）

沙門(mén)氏菌最早在1885年被發(fā)現(xiàn)，在自然界中分布較為廣泛，可引起動(dòng)物和人體患有疾病，具有傳播性。每年超過(guò)3 000萬(wàn)人感染沙門(mén)氏菌，引起死亡20多萬(wàn)人。作為革蘭氏陰性菌的一種，菌群種類(lèi)較多，在豬肉、雞肉、海產(chǎn)品等食物中都可受到沙門(mén)氏菌的污染，如果被人攝食，進(jìn)而導(dǎo)致人體疾病的發(fā)生。近10年間，由沙門(mén)氏菌引發(fā)的中毒事件達(dá)到166起，累計(jì)發(fā)病近9 000人，主要由腸炎沙門(mén)氏菌菌群所引起，而沙門(mén)氏菌中毒事件主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，天氣炎熱，菌群生長(zhǎng)繁殖較快，更多由交叉污染或者加工不當(dāng)引起。因此，能夠快速檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌對(duì)人類(lèi)公共安全和食品安全都具有重要意義。

1 檢測(cè)方法

目前，利用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌是標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但操作復(fù)雜、耗時(shí)太久，影響事件結(jié)果，隨著科技的發(fā)展和分子生物學(xué)的興起，各種先進(jìn)技術(shù)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。

1.1 PCR技術(shù)檢測(cè)

武曉松等人[1]對(duì)蔬菜中沙門(mén)氏菌建立了一種快速檢測(cè)的PCR方法。其根據(jù)特異基因設(shè)計(jì)引物并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)沙門(mén)氏菌不同濃度菌懸液產(chǎn)物與平板菌落數(shù)的對(duì)應(yīng)線性關(guān)系確定沙門(mén)氏菌的檢出限。研究發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)氏菌穩(wěn)定特異性基因?yàn)閕nvA基因，對(duì)沙門(mén)氏菌檢出限為1 550 CFU/mL，對(duì)香菜的檢出限為63 CFU/g。研究建立的沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)方法可用于檢測(cè)蔬菜中沙門(mén)氏菌的污染狀況。Erik E等人[2]利用PCR技術(shù)檢測(cè)糞便中的沙門(mén)氏菌，總共測(cè)試了391個(gè)樣本，該方法的靈敏度為0.88，并且在100個(gè)非種子樣品中沒(méi)有獲得假陽(yáng)性結(jié)果。在PCR分析之前沒(méi)有進(jìn)行DNA提取，方法非常簡(jiǎn)單。總體結(jié)果清楚地表明，包括所有動(dòng)物物種和所有血清型的糞便，MSR表現(xiàn)最佳，其中一個(gè)計(jì)算精度為99%，計(jì)算靈敏度為98%。該方法與各種商業(yè)ELISA方法和NMKL方法比較，檢測(cè)的靈敏度密切依賴于研究起源使用的糞便和要檢測(cè)的沙門(mén)氏菌菌株。此方法篩選成本非常低，如果在Selekta富集中的孵育時(shí)間延長(zhǎng)，該方法可進(jìn)一步提高其靈敏度。Whyte P等人[3]研究原始肉雞屠體中沙門(mén)氏菌的流行情況并對(duì)其進(jìn)行了一項(xiàng)調(diào)查，在商業(yè)肉雞屠宰設(shè)施的40個(gè)雞群中共獲得198個(gè)頸部皮膚樣品。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和沙門(mén)氏菌特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)試評(píng)估沙門(mén)氏菌的存在。使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從所有樣品中的32個(gè)（16%） 回收沙門(mén)氏菌。相比之下，PCR測(cè)定證明更敏感，并且在38個(gè)（19%） 測(cè)試樣品中檢測(cè)到沙門(mén)氏菌DNA。當(dāng)組合培養(yǎng)和PCR結(jié)果時(shí)，在198個(gè)樣品中的45個(gè)（23%）中檢測(cè)到病原體。當(dāng)檢測(cè)到雞群中的沙門(mén)氏菌時(shí)，PCR檢測(cè)的靈敏度也大于培養(yǎng)物（通過(guò)PCR檢測(cè)53%的雞群，通過(guò)培養(yǎng)檢測(cè)30%的雞群）。2項(xiàng)測(cè)試的結(jié)合顯示，55%的雞群被沙門(mén)氏菌感染。PCR檢測(cè)證明是檢測(cè)沙門(mén)氏菌的高度特異性和靈敏的方法，并且結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)和常規(guī)PCR檢測(cè)可以有效地提供肉雞胴體中該病原體流行的更準(zhǔn)確的概況。

盡管定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）導(dǎo)致了微生物檢測(cè)的進(jìn)步，但由于PCR抑制劑的存在，復(fù)雜的環(huán)境樣品（如沉淀物）仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。水生沉積物積聚顆粒結(jié)合的微生物污染物，從而反映累積的微生物負(fù)荷隨時(shí)間的變化。相對(duì)較新的液滴數(shù)字PCR（ddPCR）已成為一種直接定量方法，對(duì)PCR抑制劑具有高度耐受性，并放棄了校準(zhǔn)/標(biāo)準(zhǔn)曲線的必要性。Singh G等人[4]研究比較了ddPCR與qPCR在南非德班非正式定居點(diǎn)附近的Palmiet和沉積物中沙門(mén)氏菌的定量分析。與qPCR相比，ddPCR顯著提高了分析靈敏度和低濃度沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。從qPCR和ddPCR測(cè)量的預(yù)期拷貝數(shù)顯示出良好的R2值（分別為0.999和0.994）。主要受非正規(guī)定居點(diǎn)影響的部位在qPCR和 ddPCR中分別表現(xiàn)出 255±37和818±30沙門(mén)氏菌/g（p＜0.000 1） 的沙門(mén)氏菌。用ddPCR改進(jìn)沉積物中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，使其成為多種環(huán)境樣品中沙門(mén)氏菌定量的有前途的技術(shù)方法。

1.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是分子生物學(xué)與計(jì)算機(jī)應(yīng)用的一種融合，是指DNA片段經(jīng)過(guò)CR擴(kuò)增之后，基于核酸雜交原理，將這些基因序列標(biāo)記為未知靶基因序列，將其與集合了大量已知序列探針的基因芯片上特定的基因位點(diǎn)上的探針進(jìn)行雜交，再通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)對(duì)基因信息進(jìn)行分析。一次可對(duì)大量核酸分子進(jìn)行檢測(cè)分析，彌補(bǔ)了PCR免疫雜交等只限于檢測(cè)一種或少數(shù)幾種靶標(biāo)微生物或基因。

陳昱等人[5]利用多重PCR和基因芯片技術(shù)檢測(cè)和鑒定沙門(mén)氏菌，選取編碼沙門(mén)氏菌腸毒素（stn）基因設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物與含特異性探針的芯片雜交。對(duì)7種細(xì)菌共26株菌進(jìn)行芯片檢測(cè)，僅3種菌得到陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，證明該方法具有很高的特異性。對(duì)模擬食品樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果一致，檢測(cè)限為50 CFU/mL。沙門(mén)氏菌基因組DNA和細(xì)菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度約為8pg。McquistonJR等人[6]開(kāi)發(fā)了一種基于沙門(mén)氏菌DNA的測(cè)定，利用其靶向編碼Kauffmann-White血清分型鞭毛抗原（fliC和fljB）的基因。研究結(jié)果表明，在測(cè)定中檢測(cè)到的36種抗原正確鑒定了461種（92.2%） 分離物。在被認(rèn)為正確鑒定的分離株中，47個(gè)（9.4%） 是部分血清型。未正確鑒定的39種（7.8%）菌株具有應(yīng)該通過(guò)測(cè)定檢測(cè)到但未檢測(cè)到的抗原。分子檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法相比具有更高的通量，同時(shí)保持了Kauffmann-White血清分型方案的完整性。張蓓蕾[7]利用糖芯片技術(shù)快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌，制作不同類(lèi)型的糖芯片用于優(yōu)化糖芯片檢測(cè)條件，通過(guò)降低糖濃度或細(xì)菌濃度確定糖芯片檢測(cè)限值，研究了糖芯片在沙門(mén)氏菌和凝集素FimH拮抗劑篩選上的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，沙門(mén)氏菌可與甘露糖化合物修飾的糖芯片結(jié)合，其中，以Man-1與NHS玻片所構(gòu)建的糖芯片效果最優(yōu)，并且2種不同的沙門(mén)氏菌（ATCC31685和ATCC9184）與糖芯片的結(jié)合能力不同，因此糖芯片可作為沙門(mén)氏菌的一種快速檢測(cè)手段，在糖濃度為313 mmol/L或細(xì)菌濃度1×106CFU/mL時(shí)熒光信號(hào)接近背景值。

1.3 免疫磁珠檢測(cè)沙門(mén)氏菌

免疫分析檢測(cè)技術(shù)是在免疫學(xué)理論基礎(chǔ)上，利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性，免疫放大技術(shù)來(lái)鑒別細(xì)菌。建立的沙門(mén)氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法大致可分為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫磁珠分離技術(shù)、免疫熒光法，在此基礎(chǔ)上還可以利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散、免疫印跡及免疫色譜技術(shù)等方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌。

Hyeon J Y等人[8]首次嘗試將免疫磁性分離（IMS），通過(guò)多重置換擴(kuò)增（MDA） 的全基因組擴(kuò)增和實(shí)時(shí)PCR結(jié)合用于檢測(cè)食物樣品中的細(xì)菌病原體。該方法可有效實(shí)現(xiàn)原始雞胸中低水平腸道腸炎沙門(mén)氏菌（SE） （6 510 CFU/g） 的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，無(wú)需培養(yǎng)富集。此外，在4 h培養(yǎng)富集后，能夠檢測(cè)到生雞胸中較低濃度（650.1 CFU/g）的冷藏應(yīng)激SE細(xì)胞，將檢測(cè)過(guò)程從數(shù)天縮短至數(shù)小時(shí)，檢測(cè)率無(wú)顯著差異與基于培養(yǎng)的檢測(cè)方法相比。與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)PCR相比，通過(guò)顯著提高SE檢測(cè)的性能，證明了IMS-MDA實(shí)時(shí)PCR作為檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的快速、靈敏且經(jīng)濟(jì)方法的潛力。

沙門(mén)氏菌大約有2 400種血清型，然而95%引起沙門(mén)氏菌病的菌株是屬于血清群A±E的40種血清型。常規(guī)的預(yù)濃縮肉湯，選擇性濃縮肉湯和濃縮液差異瓊脂需要72±96 h才能實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的假定鑒定。然而，免疫磁分離（IMS） 取代了24 h選擇性富集使用順磁顆粒進(jìn)行10 min免疫捕獲程序。然而，該程序需要在選擇性培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)作為終點(diǎn)檢測(cè)點(diǎn)。因此，結(jié)合通過(guò)IMS選擇性固定靶細(xì)胞和第二檢測(cè)抗體的基于ELISA的末端檢測(cè)方法將是非常有利的。Mansfield L P等人[9]將IMS技術(shù)與基于ELISA的程序結(jié)合使用沙門(mén)氏菌屬特異性單克隆抗體M105。該抗體特異于沙門(mén)氏菌脂多糖的外核心區(qū)域，因此，它與沙門(mén)氏菌Ra粗突變體的LPS上的表位結(jié)合，而不與Rc或Re沙門(mén)氏菌粗突變體的LPS結(jié)合。Zhang S等人[10]制備了沙門(mén)氏菌特異性抗體，并建立快速檢測(cè)肉制品中沙門(mén)氏菌的ELISA系統(tǒng)。研究用6種致病性沙門(mén)氏菌制備的抗原免疫BALB/c小鼠和兔；用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合。結(jié)果表明，獲得了1株雜交瘤（6E7CGMCC10313）穩(wěn)定分泌單克隆抗體（M23） 和多克隆抗體（P23）。制備的高純度抗體滴度為1∶1.28×106和1∶8.0。P23作為包被抗體吸附在96孔微量滴定板上，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記M23。建立夾心ELISA檢測(cè)肉樣品污染。LOD為800 CFU/g。該ELISA系統(tǒng)靈敏度高，具有良好特異性，研究適用于肉類(lèi)定性和半定量快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌。

1.4 免疫熒光檢測(cè)

免疫熒光檢測(cè)是將免疫學(xué)檢測(cè)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，具體操作是先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體（抗原），再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原。Pandey S K等人[11]研究了一種新的夾心型熒光免疫分析格式，使用多黏菌素B，一種陽(yáng)離子受體分子，作為黏合劑，而抗Vi抗體作為特異性檢測(cè)沙門(mén)氏菌血清型傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲劑。針對(duì)Vi-BSA綴合物產(chǎn)生的抗ViIgG抗體顯示出7.779 nM-1的親和力，表示Vi多糖中O-乙?；拿庖唢@性。所開(kāi)發(fā)測(cè)定的檢測(cè)限為約101細(xì)胞mL-1的Vi表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌血清型Typhi，相關(guān)系數(shù)（R2）等于0.97。對(duì)于所有測(cè)試的血清型Typhi臨床分離株以及加標(biāo)血液樣品的病原體獲得的陽(yáng)性反應(yīng)推薦Vi抗原作為傷寒期間的生物標(biāo)志物的特異性和準(zhǔn)確性。Vi加標(biāo)樣品的批內(nèi)和批間精密度均令人滿意，顯示方差系數(shù)（CV%），平均值分別為4.05%和5.97%。

1.5 傳感技術(shù)檢測(cè)鑒定

以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)，金屬有機(jī)骨架材料是由金屬離子或金屬簇和有機(jī)配體通過(guò)自組裝而形成的一類(lèi)新型納微結(jié)構(gòu)功能材料，制備熒光生物傳感器。利用核酸適配體的高親和力與高特異性識(shí)別能力，可快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏、特異性高檢測(cè)沙門(mén)氏菌。目前，用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)的傳感器包括酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、電化學(xué)生物傳感器、基因傳感器和光敏傳感器等。

蔣曉華等人[12]基于金屬有機(jī)骨架材料的熒光猝滅特性以及對(duì)核酸適配體的吸附性，結(jié)合核酸適配體的高親和力與高特異性識(shí)別能力，構(gòu)建了針對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)的熒光生物傳感器。利用金屬有機(jī)骨架材料-核酸適配體熒光法檢測(cè)沙門(mén)氏菌。研究結(jié)果表明，構(gòu)建的熒光傳感器的信號(hào)與沙門(mén)氏菌濃度的對(duì)數(shù)在1×101～1×105CFU/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限（S/N=3） 為7 CFU/mL，將該方法用于蝦肉樣品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，加標(biāo)回收率為90.0%～108.0%，該傳感器對(duì)沙門(mén)氏菌有較好的選擇性與靈敏度。Fei J等人[13]將電化學(xué)免疫傳感器用于雞傷寒沙門(mén)氏菌和雞白痢沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。通過(guò)制備的傳感器用于捕獲抗體、提高信號(hào)強(qiáng)度的金納米粒子的電沉積。捕獲結(jié)果表明對(duì)雞傷寒沙門(mén)氏菌和雞白痢沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限均為3×103CFU/mL。該研究中提供的電化學(xué)免疫傳感器敏感性高、特異性強(qiáng)，且重復(fù)性好的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。

1.6 其他技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌

為了彌補(bǔ)單一檢測(cè)技術(shù)的不足，研究者們將各種檢測(cè)技術(shù)，如光譜技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、納米技術(shù)、傳感技術(shù)、電子顯微技術(shù)和以微生物代謝為基礎(chǔ)的阻抗法等相互結(jié)合，為檢測(cè)和鑒定致病性沙門(mén)氏菌帶來(lái)了新契機(jī)。高分辨熔解曲線檢測(cè)是在PCR擴(kuò)增之后，利用擴(kuò)增產(chǎn)物的差別，它們產(chǎn)生的熔解曲線也會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)識(shí)別熔解曲線的變化來(lái)區(qū)分產(chǎn)物，核酸序列的遺傳差異，進(jìn)而憑借熔解曲線數(shù)據(jù)對(duì)來(lái)源不同的沙門(mén)氏菌進(jìn)行分類(lèi)和分型。

Zeinzinger J等人[14]基于fljB，gyrB和ycfQ片段中的特定單核苷酸多態(tài)性，開(kāi)發(fā)了三重基因掃描測(cè)定法并評(píng)估了腸道沙門(mén)氏菌分離株的血清型特異性亞型分析。通過(guò)對(duì)含有46種不同血清型的417株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，同時(shí)對(duì)fljB，gyrB和ycfQ進(jìn)行基因掃描，可以對(duì)37種血清型進(jìn)行明確、簡(jiǎn)便、快速的鑒定。開(kāi)發(fā)的閉管三重高分辨率熔解曲線測(cè)定結(jié)合腸炎沙門(mén)氏菌特異性PCR，代表了一種改進(jìn)的方案，用于準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速地分型39種沙門(mén)氏菌血清型。

Fei Jia等人[15]將納米技術(shù)、電子顯微技術(shù)及電化學(xué)阻抗譜等技術(shù)于一體，將氧化還原石墨烯的納米復(fù)合材料 （rGO） 和羧基改性的多壁碳納米管（MWCNTs）直接固定在玻碳電極表面，利用沙門(mén)氏菌的氨基修飾的特異性核酸適配體與rGO-MWCNT通過(guò)酰胺鍵共價(jià)結(jié)合。通過(guò)透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡來(lái)觀察描述rGOMWCNT的形態(tài)，利用電化學(xué)阻抗譜監(jiān)測(cè)。研究結(jié)果表明，此裝置可實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的量化檢測(cè)，檢測(cè)范圍75～7.5×105CFU/mL，檢測(cè)限為25 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間為1 h。

2 結(jié)語(yǔ)

沙門(mén)氏菌病對(duì)動(dòng)物及人體都會(huì)造成一定的病菌感染，應(yīng)對(duì)其防治加以重視。隨著人們對(duì)沙門(mén)氏菌關(guān)注度的提高，沙門(mén)氏菌檢測(cè)及鑒定也得到了不斷發(fā)展，利用傳統(tǒng)方法，諸如分子生物學(xué)檢測(cè)、生化檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)。耗時(shí)較長(zhǎng)、操作過(guò)程復(fù)雜，不能及時(shí)給出食品安全性評(píng)價(jià)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)雖然快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性較強(qiáng)，但對(duì)設(shè)備、技術(shù)人員、環(huán)境要求較高，難以推廣普及。每一種檢測(cè)技術(shù)都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，目前有較多新型的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行交叉使用，各取其優(yōu)點(diǎn)。