豬肉中沙門氏菌污染情況及檢測(cè)方法進(jìn)展

危 夢(mèng)，晏宸然，黃嘉玲，張孝琴，陳 璐，劉文龍

（1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都 610106；2.成都大學(xué)四川省肉類加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106）

沙門氏菌是導(dǎo)致人類食物傳播疾病的主要病原菌之一，最適繁殖溫度是37℃，在豬肉和豬肉制品中的污染率很高。沙門氏菌不僅活菌能夠產(chǎn)生中毒性反應(yīng)，其腸毒素也會(huì)導(dǎo)致食物中毒，有超過2 000種血清型，由沙門氏菌導(dǎo)致的食物中毒，致死率約為4%[1]。沙門氏菌通過直接和間接的渠道，很容易在動(dòng)物和人類之間傳播，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食物中的沙門氏菌是防止和控制沙門氏菌傳播的重要手段。

豬肉是我國(guó)人民的主要消費(fèi)肉制品，豬肉制品的安全性將會(huì)直接影響到消費(fèi)者的健康。食品污染中病原微生物引起的食品傳播疾病是影響食品安全的重要因素之一，沙門氏菌引起的食物中毒占很大比例[2]。因此，豬肉中沙門氏菌的污染引起了許多學(xué)者和專家的廣泛關(guān)注。

1 沙門氏菌的傳染途徑

沙門氏菌是世界上最嚴(yán)重的食源性疾病微生物之一。沙門氏菌存在于豬成長(zhǎng)的各種時(shí)期，在新宰殺的豬肉深層組織中是不存在沙門氏菌的，但是在屠宰、運(yùn)輸、售賣、貯藏過程中都會(huì)引起沙門氏菌的污染[3]。Hald T等人[4]的研究結(jié)果表明，在歐洲，由于食用受污染的豬肉產(chǎn)品而導(dǎo)致的沙門氏菌感染占10%～23%。在我國(guó)豬肉工業(yè)中，沙門氏菌的檢測(cè)頻率非常高，豬場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的最高檢測(cè)率可達(dá)78.82%，最終零售豬肉發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的平均概率為15%[5]。沙門氏菌的生存能力非常強(qiáng)，在屠宰場(chǎng)的各個(gè)地方都能找到，工作人員的操作不規(guī)范會(huì)加重沙門氏菌的污染。后來，隨著對(duì)沙門氏菌污染情況的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨意給家畜服用抗菌類藥物，會(huì)導(dǎo)致沙門氏菌的污染情況加重。然而我國(guó)的屠宰情況不容樂觀，很多小作坊在尸體加工和分割過程中缺乏嚴(yán)格的溫度控制設(shè)施，在整個(gè)生產(chǎn)過程中缺乏有效的控制措施，使得我國(guó)沙門氏菌在屠宰和加工過程中的交叉污染現(xiàn)象層出不窮，給我國(guó)消費(fèi)者帶來安全隱患[6]。

2 沙門氏菌的檢測(cè)方法

2.1 傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法

目前，在中國(guó)檢測(cè)食品中沙門氏菌，主要以（GB 4789.4—2016） 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢測(cè)沙門氏菌檢驗(yàn)》為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在這個(gè)檢測(cè)方法中，檢測(cè)過程可分為5個(gè)階段，即預(yù)增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定和分型。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法繁瑣費(fèi)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果至少需要4～7 d。它不僅更多地依靠人工操作和主觀判斷，而且腸桿菌的細(xì)菌之間的生化反應(yīng)也交叉重疊，在速度、敏感性和特異性方面有其自身的局限性，不能及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行食品安全評(píng)價(jià)[7]。該方法的檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，并且十分復(fù)雜，不適宜大量且快速的檢測(cè)。目前，在按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法增加細(xì)菌后，以沙門氏菌為鑒定媒介，判定菌種類別。由于它提供沙門氏菌的生長(zhǎng)條件和抑制雜菌的生長(zhǎng)，可以縮短檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間，顯色培養(yǎng)基在快速檢測(cè)沙門氏菌中應(yīng)用廣泛。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 技術(shù)檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 技術(shù)于20世紀(jì)80年代首次應(yīng)用到沙門氏菌的檢測(cè)中，利用該技術(shù)只需要存在一點(diǎn)DNA片段，就能夠用PCR進(jìn)行擴(kuò)增放大，增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性[8]，該技術(shù)可以看作是一種對(duì)特定的DNA片段在生物體外進(jìn)行快速擴(kuò)增。PCR技術(shù)的試驗(yàn)需要專業(yè)儀器，出現(xiàn)假陽性及假陰性的結(jié)果較大，造成試驗(yàn)誤差，但是PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單方便、適合微量抗原、自動(dòng)化程度高的檢測(cè)。因此，PCR檢測(cè)技術(shù)在豬肉中沙門氏菌的檢測(cè)中也應(yīng)用廣泛。

Alves J等人[9]利用多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)彎曲桿菌和沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠縮短檢測(cè)沙門氏菌的時(shí)間，并且能夠有效鑒別假陰性問題，大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。王敏亞等人[10]研究了熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)常見食源性病原菌，并利用熒光定量PCR和常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法檢測(cè)720個(gè)樣本中的病原菌，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，對(duì)食源性病原體進(jìn)行定量的PCR檢測(cè)是一種快速、可靠、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

2.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)應(yīng)用的融合，目前處于逐漸發(fā)展的階段?；蛐酒夹g(shù)是指DNA片段被PCR擴(kuò)增后，這些基因序列被標(biāo)記為未知的目標(biāo)基因序列，帶有熒光標(biāo)記的樣本分子與固定基因芯片上的分子探針雜交，確定了某些特定微生物的存在，目前在食品的檢測(cè)中基因芯片技術(shù)應(yīng)用廣泛，具有檢測(cè)效率高、結(jié)果精準(zhǔn)、方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[11]。

陳昱[12]利用多重PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)對(duì)人工模擬樣品和實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，這2種方法結(jié)合檢測(cè)這3種細(xì)菌的靈敏度可達(dá)50 CFU/mL，多重PCR電泳的靈敏度為500 CFU/mL。通過比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因芯片技術(shù)在自動(dòng)化方面不僅高于PCR技術(shù)，而且具有較高的檢測(cè)靈敏度。許俊鋼[13]用基因芯片檢測(cè)常見致病菌，選擇了4種常見的臨床致病菌對(duì)30份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。所有細(xì)菌試驗(yàn)均在8 h內(nèi)完成，與傳統(tǒng)的臨床試驗(yàn)方法相比，平均時(shí)間縮短了1/3，并且得到了較為精準(zhǔn)的結(jié)果，檢測(cè)效率得到較大提高。結(jié)果表明，基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌，是細(xì)菌快速檢測(cè)的發(fā)展方向。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法比傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度高2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)時(shí)間僅需0.5 h，并且不需要特殊儀器，操作方便[14]。但環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法存在的假陽性問題嚴(yán)重，有些樣品不能使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，目前已在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。

萬進(jìn)等人[15]用沙門氏菌的高度保守基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，建立了等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)。牛奶中35株沙門氏菌的快速檢測(cè)率達(dá)到100%。沒有檢測(cè)到其他陰性菌株的基因組。結(jié)果表明，該方法省時(shí)、特異性強(qiáng)，適用于牛奶中沙門氏菌污染的快速檢測(cè)。王瑾等人[16]建立了實(shí)時(shí)熒光定量周期等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)沙門氏菌的方法，45 min就能完成檢測(cè)，同時(shí)靈敏度得到提升，檢測(cè)相關(guān)性為0.985 1。同時(shí)，雞沙門氏菌的檢測(cè)時(shí)間縮短到7 h，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。孔超等人[17]建立了一種快速準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)食物中的沙門氏菌基因，對(duì)50個(gè)樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA稀釋10倍后，分別進(jìn)行了LAMP和PCR反應(yīng)，評(píng)估該方法的特異性和靈敏性。該方法能夠有效檢測(cè)40 mm范圍內(nèi)的沙門氏菌，其中靈敏度高于PCR法，特異性與PCR方法相當(dāng)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、快速、可靠，可在基礎(chǔ)檢驗(yàn)部門中推廣應(yīng)用。

2.5 免疫磁珠技術(shù)

免疫磁珠技術(shù)是一種以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的新型檢測(cè)技術(shù)。免疫磁珠分離作為一種新的免疫技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。該技術(shù)可以提高測(cè)量樣品的分離度，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)易與其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，能大大縮短檢測(cè)時(shí)間，目前已廣泛應(yīng)用于食源性病原體的檢測(cè)中[18]。

王海明等人[19]利用免疫磁珠技術(shù)快速對(duì)食源性中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)周期約為 40 h，檢測(cè)限值小于10 CFU/25 g。結(jié)果表明，該方法能有效加強(qiáng)目標(biāo)菌的富集程度，同時(shí)顯著提高食品樣品中沙門氏菌檢測(cè)的敏感性和特異性。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法是免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法，是一種將抗原和抗體結(jié)合保持其特異性反應(yīng)與酶的高效催化活性結(jié)合的一種生物應(yīng)用技術(shù)，ELISA方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，因此常常用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)。

黃金林等人[20]采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)多種樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，并采用國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法的特異性和靈敏性分別為97.3%和100%。此外，還有研究者建立了一種檢測(cè)三明治中鼠傷寒沙門氏菌的方法，結(jié)果表明，該方法檢測(cè)時(shí)間較短、檢測(cè)成本較低、檢測(cè)結(jié)果較好。

3 結(jié)語

沙門氏菌作為一種常見致病菌，常常會(huì)導(dǎo)致食物中毒，對(duì)人體造成嚴(yán)重傷害，因此沙門氏菌的檢測(cè)受到越來越多的關(guān)注，與此同時(shí)，沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)也在不斷提升。對(duì)豬肉中的沙門氏菌進(jìn)行控制是十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，可以通過提升屠宰場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境，控制豬肉中沙門氏菌的繁殖。其次，還可以在豬肉的運(yùn)輸、銷售、儲(chǔ)存過程中通過控制沙門氏菌，避免食物中毒的發(fā)生。

沙門氏菌病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的影響較大，可以通過日常的養(yǎng)護(hù)管理、定期的消毒和檢疫過程來控制沙門氏菌的繁殖。同時(shí)，如果養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)沙門氏菌的感染狀況，應(yīng)該第一時(shí)間采取隔離措施，并進(jìn)行消毒和殺菌，從而減少沙門氏菌造成的損失。目前，沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)處于不斷發(fā)展的狀態(tài)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜大批量的樣品中沙門氏菌的檢測(cè)，因此以分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法和以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，被越來越多的檢測(cè)人員使用。檢測(cè)沙門氏菌的方法多種多樣，每一種沙門氏菌的檢測(cè)方法都有利有弊，所以更多的檢測(cè)方法是將2種或2種以上的檢測(cè)方法相結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，從而使檢測(cè)效果更好、檢測(cè)過程更簡(jiǎn)便。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，沙門氏菌檢測(cè)方法發(fā)展迅速，但還存在大量的問題，如檢測(cè)成本過高、需要技術(shù)要求過大、檢測(cè)方法僅適用小部分樣品、不適用各種種類的沙門氏菌檢測(cè)、同時(shí)檢測(cè)條件過高不適用于大眾檢測(cè)等。所以，研究和發(fā)展檢測(cè)結(jié)果更靈敏、方法更簡(jiǎn)便、時(shí)間更短的檢測(cè)技術(shù)是目前的一種趨勢(shì)。在我國(guó)龐大的食品工業(yè)中，沙門氏菌檢測(cè)新技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，能夠很好地預(yù)防和控制沙門氏菌疾病的發(fā)生。