淺談如何提高“蔗糖酶酶學性質與酶促反應動力學”實驗結果的可重復性

鄧祥宜，程占云，方雨婷

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北武漢 430205）

0 引言

酶是生物化學的重要內容。其中，酶的酶學性質及酶促反應動力學是教學的重點和難點。開設酶學實驗有利于學生在實際操作中充分理解相關知識、掌握實驗技巧。學校生物工程、食品科學與工程、食品質量與安全專業(yè)的“生物化學實驗”課程開設了綜合性較強的“蔗糖酶酶學性質與酶促反應動力學”實驗。教學中，該實驗重復性欠佳，不少小組間測定結果偏差較大；通過多年教學，結合每次實驗的情況，筆者分析總結，對如何上好該實驗有了一些體會。同時，實驗中的關鍵控制點也可為其他酶學實驗的教學和科研工作提供參考。

1 實驗主要內容簡介

學校生物化學實驗使用內部編寫的教材，“蔗糖酶酶學性質與酶促反應動力學”實驗要求從酵母粉中提取蔗糖酶，催化底物蔗糖水解，通過3,5-二硝基水楊酸（DNS）法檢測產物還原糖的生成量，計算酶促反應速度。通過比較不同溫度、不同pH值下的酶促反應速度，確定酵母蔗糖酶的最適溫度、最適pH值；在最適溫度、最適pH值條件下，通過測定不同底物濃度下的酶促反應速度，繪制雙倒數(shù)曲線（Lineweaver-Burk曲線），從而求得蔗糖酶的Km值，以及該酶量對應的Vmax。

2 教學的主要目標及問題

實驗的教學目標是讓學生通過實驗現(xiàn)象充分認識溫度、pH值、底物濃度對酶活力的影響，掌握測定酶最適溫度和最適pH值的方法，以及酶促動力學測定Vmax和Km的方法。但是在上課過程中，常常出現(xiàn)小組間的實驗結果不相同，最適溫度、最適pH值、Km的測定偏離明顯，而且蔗糖酶的最適溫度受開課時氣溫高低影響明顯。如何讓所有小組的結果趨近于一致，使不同小組的學生都能準確地測定出相關指標，是擺在教師面前的緊迫問題。

3 問題的解決

科學實驗必須經得起反復檢驗，實驗不僅要某個人自己能重復做出來，還要不同的人能重復做出來。實驗在大二上學期開設，學生專業(yè)技能是有限的，不經過上課時的專門強調和有針對性的指導，往往達不到預期目標。筆者經過多年教學的觀察和分析，找出了實驗的關鍵控制點，從而提高了實驗結果的可重復性，讓學生更容易獲得成功的喜悅、建立學習的自信。

3.1 關于酶液的制備和稀釋

為了增強實驗的綜合性和模擬真實的研究，實驗中要求每個小組從酵母粉中提取蔗糖酶用于該實驗，由于每個小組提取液中的蔗糖酶濃度存在差異，導致顯色后吸光度偏離有效范圍的情況時有發(fā)生，甚至導致實驗無法按時完成。因此，在實驗開課前，由教師通過預實驗確定酵母蔗糖酶提取的較好條件：酵母粉添加量（每批酵母粉蔗糖酶活力存在差異，且受存放時間影響）、加水量、研磨時間、稀釋倍數(shù)等。實驗中，要求各組將提取的蔗糖酶交給教師混勻（消除各組提取的蔗糖酶濃度差異，讓全班使用相同濃度的酶），再分發(fā)給各組單獨進行梯度稀釋，摸索獲得合適的稀釋倍數(shù)，經教師匯總相關結果后，全班確定統(tǒng)一稀釋倍數(shù)用于該實驗的研究，從而避免了各組酶濃度、稀釋倍數(shù)差異可能造成的混亂，保證實驗均能按時完成。

3.2 酶促反應pH梯度的設置

按照原先的實驗設計，酶促反應考查pH值3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，教學過程中，一些小組測定的最適pH值為4.0，也有一些為5.0，經常會有學生問到底最適pH值為多少，哪個是對的，面對這個問題，筆者讓學生通過課外興趣實驗測得蔗糖酶的最適pH值在4.5～4.6（一些實驗教材中蔗糖酶酶活測定使用pH值4.6[1]），于是將實驗的pH值梯度調整為2.6，3.6，4.6，5.6，6.6，7.6，由于pH值4.6處的酶促反應速度顯著高于其他值，使得所有小組測定的最適pH值均為4.6，避免了先前pH值4.0，5.0處的酶促反應速度比較接近、難以判斷的問題。

3.3 關于酶促反應體系的準確量取與混勻

由于該實驗要測定酶促反應產物的多少，屬于定量實驗，所以反應體系各成分的準確量取是基礎，所有學生對于這一點的認識很到位。但在“混勻”這個環(huán)節(jié)，少數(shù)學生會出現(xiàn)問題，造成測定值存在偏差。實驗步驟中描述為“混勻”，在操作過程中，酶促反應體系小，其混勻一般比較容易，但是在“還原糖與DNS反應結束后，用水定容至15 mL”這一步，少數(shù)學生做完“混勻”操作后，刻度試管中上層液體與下層液體顏色不一致（上層液體往往偏淺），如果此時測定吸光度，取上層液體或者下層液體都不能代表該管的真實吸光度，所以實驗中要跟學生再三強調“混勻混勻，不光是混，還要混到‘勻’為止”經過反復強調，并且讓學生在測定吸光度前拿給教師檢查，解決了“混勻”這一問題。

3.4 關于反應時間和溫度的科學控制

由于是定量實驗，在反應時間的控制上必須精確，如“還原糖與DNS混勻后于沸水浴中反應5 min”，“酶促反應于37℃水浴鍋中反應10 min”等。教師給學生強調的是，計時務必“精確到秒”。實驗中，學生在沸水浴中DNS顯色、水浴鍋中酶促反應的時間控制要格外小心和準確。還原糖測定一般很準確，葡萄糖標曲的R2一般都大于0.995，但不少學生酶促反應的結果卻可能很糟糕。原來學生對“精確計時到秒”的理解僅僅是水浴鍋中酶促反應的時間，而忽略了加完酶后，在室溫下酶促反應已在進行，也忽略了酶促反應結束后從水浴鍋中取出試管至加入DNS之前，酶促反應也在繼續(xù)進行。因此，在教學中，酶促反應的精確計時除了強調“精確計時到秒”，還要強調“嚴格控制和盡量避免規(guī)定溫度外的反應時間”。具體操作時，讓學生將酶液與反應其他成分分別預熱，在混勻的一瞬間開始計時，反應結束后立即取出并加入DNS終止反應。這樣，由于反應時間的嚴格控制和預熱操作的執(zhí)行，所有小組酶的最適溫度都為37℃，雙倒數(shù)曲線的相關系數(shù)也達到了0.99左右。

4 結語

相比理論課的教學，學生對實驗課具有更大的興趣，而實驗結果的可重復性和準確性影響著學生的學習自信，進而與后來的學習態(tài)度密切相關。酶學實驗是本科教學中較難的實驗內容之一，實驗的重現(xiàn)性不太好。筆者在教學實踐中找到了酶液制備與稀釋、pH值梯度設置、體系混勻、反應時間及溫度的科學控制等4個關鍵控制點，提高了該實驗教學的重現(xiàn)性。以往部分學生因實驗結果不理想而感覺受挫，進而使其學習積極性和學習自信的情況得到了很好的解決。

對筆者而言，教師不僅是一份職業(yè)，更是被當作事業(yè)。在多年的“生物化學”教學工作中，觀察、學習、思考、總結從未停止，因而在教學中有了一些改進和感悟[2-3]。在將來的工作中，將再接再厲，因為“教師要給學生一碗水，自己要有一桶水”，而“教師要永遠裝滿一桶水，必須要有一眼泉”[3]。