環(huán)狀RNA對(duì)心血管疾病的影響

劉人可 曾研 彭道泉

環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs領(lǐng)域，甚至整個(gè)RNA領(lǐng)域中的研究重點(diǎn)，其特征是5’端和3’端連接形成環(huán)狀獨(dú)特結(jié)構(gòu)。天然circRNAs已被證實(shí)是一種豐富、穩(wěn)定、多樣和保守的RNA分子，在RNA的相互作用網(wǎng)中起著不可或缺的作用。通過(guò)測(cè)序技術(shù)，在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了豐富的circRNAs。大量研究表明其是一種具有較多的功能的內(nèi)源RNA，具有微小RNA的海綿功能，可在剪接中參與線性RNA競(jìng)爭(zhēng)；也能在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的環(huán)節(jié)起到作用[1]。此外，circRNAs被證實(shí)涉及許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，其在心血管疾病的作用已成為研究熱點(diǎn)[2]。

1 CircRNAs的發(fā)現(xiàn)和分布

CircRNAs是一組“古老”而又“新鮮”的非編碼RNA分子(non-coding RNA，ncRNA)，于1976年在植物病毒中被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的突破，發(fā)現(xiàn)認(rèn)為circRNAs廣泛存在于真核細(xì)胞中，包括蒼蠅、哺乳動(dòng)物和人類。2013年，Hansen等[3]發(fā)現(xiàn)circRNAs的重要作用。越來(lái)越多的研究表明，circRNAs參與疾病起始和進(jìn)展，可作為新的臨床診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

2 CricRNAs的合成

2.1 剪接體依賴性環(huán)化途徑。

大多數(shù)真核生物circRNAs在選擇性剪接過(guò)程中產(chǎn)生，由機(jī)械剪切力或Ⅰ/Ⅱ組核酶催化。反向剪接反應(yīng)的加工需要規(guī)范剪接體，circRNAs是一種能夠調(diào)節(jié)剪接和催化環(huán)化形成的順式調(diào)節(jié)元件[3-4]。雖然具體的機(jī)制未知，相對(duì)合理的解釋認(rèn)為隨著剪接小核核糖(splicing nuclear RNA，snRNPs)在前體信使RNA上的連續(xù)組裝，外顯子的下游5’供體部位與上游3’受體位點(diǎn)相結(jié)合催化circRNAs合成。與經(jīng)典的剪接相比，反向剪接的效率非常低，可能是因?yàn)榉聪蚣艚硬焕诩艚芋w的組裝。

2.2 內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化和套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化途徑。

在“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”過(guò)程中，大量的circRNAs依賴于內(nèi)含子反向互補(bǔ)的模體，互補(bǔ)的片段兩端分別是GU富集片段和C富集片段，兩者首尾相連，形成的circRNAs能避免被RNA酶水解。而原始轉(zhuǎn)錄中的供體與受體配對(duì)可使5’端至3’端緊緊相連，促進(jìn)外顯子的環(huán)化。套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化由量個(gè)外顯子組成的剪接供體共價(jià)結(jié)合，切除中間所有內(nèi)含子形成的circRNAs。經(jīng)典的跳讀外顯子跳躍導(dǎo)致鎖狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，是這個(gè)模型的關(guān)鍵并可以促進(jìn)外顯子的環(huán)化。

3 CircRNAs的功能

3.1 微小RNA的“海綿”功能

CircRNAs是一種新型的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs，作為微小RNA的“海綿”，它能與其結(jié)合并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)反向調(diào)節(jié)相關(guān)微小RNA。已知微小RNA與靶向信使RNA的非翻譯區(qū)(3’UTR)的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，抑制蛋白翻譯，或促進(jìn)信使RNA轉(zhuǎn)錄后的降解[5]。CircRNAs可調(diào)節(jié)微小RNA靶基因的活性，在調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮間接的作用，影響微小RNA的生物學(xué)功能。CiRS7(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)是最近確定的人類circRNAs，其擁有超過(guò)70個(gè)常規(guī)的微小RNA7結(jié)合位點(diǎn)，因此被稱為miR7的超級(jí)“海綿”[1，6]。CiRS7與小鼠腦中的微小RNA7共表達(dá)，特別是在大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中。通過(guò)促進(jìn)核酸外切裂解實(shí)現(xiàn)，其可有效抑制微小RNA7活性、導(dǎo)致微小RNA7靶向轉(zhuǎn)錄水平的增加，抑制微小RNA與其介導(dǎo)靶點(diǎn)之間的穩(wěn)定性[7]。

3.2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)

大多數(shù)由內(nèi)含子形成的circRNAs位于細(xì)胞核中，幾乎無(wú)微小RNA結(jié)合功能。但有研究發(fā)現(xiàn)，敲除circRNAs后可阻止相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。CircRNA circ-ankrd52位于與其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，并可促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ的功能。初步證明，circRNAs的功能是促進(jìn)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)槟承ヽircRNAs具有RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)，它可通過(guò)結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ，調(diào)節(jié)選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄過(guò)程[8]。EIciRNA(exonic-intronic circRNA)由外顯子和內(nèi)含子合成，也主要定位在細(xì)胞核中，對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。U1snRNP(small nuclear ribonucleic proteins)是U1小核RNA剪切時(shí)用到的一種小核RNA，可相互作用，通過(guò)相互結(jié)合增強(qiáng)親本基因的表達(dá)[6]。CircRNAs可與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)形成復(fù)合物，抑制轉(zhuǎn)錄或通過(guò)WatsonCrick堿基配對(duì)原則，直接調(diào)控信使RNA的表達(dá)[7]。許多其他含有翻譯起始位點(diǎn)的circRNAs也具有類似的功能。因此，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)是circRNAs一個(gè)重要的功能。

3.3 翻譯水平的調(diào)節(jié)

研究證明，在真核細(xì)胞中若環(huán)狀mRNA含有可直接與核糖體結(jié)合的“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”(internal ribosome entry site，IRES)序列，被翻譯。而真核生物核糖體40S亞基無(wú)論在體外或體內(nèi)，一旦在入口點(diǎn)與circRNAs結(jié)合后就能夠啟動(dòng)翻譯。此外，Naoko等[9]發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中，含有無(wú)限開放閱讀框(open reading frame，ORF)的circRNAs也可被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。其他研究表明，將含有綠色熒光蛋白的開放閱讀框連接入circRNAs中，可在大腸桿菌中成功轉(zhuǎn)錄綠色熒光蛋白[10]。一些circRNAs可在活的人類細(xì)胞中翻譯，不受常規(guī)翻譯啟動(dòng)中必不可少的第三部分的影響，比如內(nèi)部核糖體進(jìn)入部位、polyA尾或帽結(jié)構(gòu)等。此外，circRNAs可通過(guò)類似于聚合酶反應(yīng)的滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)的方式在真核轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。無(wú)需與RNA模版多次結(jié)合，circRNAs不僅可產(chǎn)生長(zhǎng)重復(fù)序列，還可在一定時(shí)間段內(nèi)達(dá)到比其線性RNA更高的生產(chǎn)力[9]。EIciRNAs可對(duì)mRNA進(jìn)行狙擊，通過(guò)隔離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的方法減少線性RNA的翻譯。EIciRNA形成時(shí)可發(fā)生可變剪接，線性RNA缺少翻譯起始點(diǎn)而無(wú)法進(jìn)行翻譯[11]。因此，存在于人類細(xì)胞中的外顯子circRNAs的翻譯比先前想象的更有可能。但僅外源性circRNAs才能在真核細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)，迄今無(wú)直接證據(jù)能證明天然真核內(nèi)源性circRNAs可被翻譯。

3.4 環(huán)化過(guò)程影響選擇性剪接

通常，circRNAs被認(rèn)為是蛋白質(zhì)編碼基因剪接過(guò)程的特殊功能性副產(chǎn)物。大部分circRNAs都是外顯子。因此circRNAs的形成過(guò)程可能會(huì)影響相關(guān)preRNA-RNA前體的選擇性剪接，導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。RNA結(jié)合模體蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)，對(duì)于源自Titin基因I帶的circRNAs亞型的合成至關(guān)重要。在RBM20敲除小鼠中，最初源自circRNAs合成的外顯子在線性RNA中更加濃縮[12]。因此，被環(huán)化的外顯子越多則其對(duì)應(yīng)的信使RNA的外顯子越少。雖然還未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的circRNAs可被翻譯成蛋白質(zhì)，但可推測(cè)某些基因剪接相關(guān)蛋白的過(guò)表達(dá)或缺失也可通過(guò)影響circRNAs來(lái)調(diào)節(jié)信使RNA的合成，進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

4 CircRNAs與心血管疾病

最近的幾項(xiàng)研究顯示，circRNAs可能在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

4.1 心臟相關(guān)RNA(heart-related RNA，HRCR)對(duì)心臟病理性肥大和心力衰竭的作用。

內(nèi)源性調(diào)子因子微小RNA223可誘導(dǎo)心臟肥大和心衰。凋亡抑制因子ARC在心肌細(xì)胞肥大和凋亡中起保護(hù)作用，微小RNA223通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶點(diǎn)ARC發(fā)揮病理作用[13]。CircRNAs可作為微小RNA的“海綿”與微小RNA結(jié)合并影響其表達(dá)。Wang等[14]證實(shí)，心源性circRNA HRCR可以通過(guò)直接結(jié)合微小RNA223，抑制微小RNA223的活性，誘導(dǎo)ARC表達(dá)的增加，抑制心肌細(xì)胞和心臟肥大和心力衰竭。CircRNAs可能為臨床上有價(jià)值的心力衰竭生物標(biāo)志物，但需廣泛的驗(yàn)證和研究[13]。

4.2 CircRNA Cdr1as可誘導(dǎo)心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，可并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，常危及生命。在MI發(fā)展過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間的心肌缺血缺氧促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。ZNF292作為鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)，cZNF292為內(nèi)皮細(xì)胞中由缺氧誘導(dǎo)并表達(dá)的circRNAs。在缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中，cZNF292水平升高有助于內(nèi)皮細(xì)胞的形成，而circRNAs參與調(diào)控低氧心肌內(nèi)皮細(xì)胞功能[15]。轉(zhuǎn)錄因子SP1和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是微小RNA7的下游靶向基因[16]，微小RNA7通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)PARP的表達(dá)，抑制缺氧情況下的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)，Cdr1as作為circRNAs的一種，可起到微小RNA7“海綿”作用，抑制微小RNA7的活性。Cdr1as通過(guò)與微小RNA7a直接結(jié)合，降低微小RNA7a的活性，上調(diào)miR-7靶向基因(如PARP和SP1)的表達(dá)，加重心肌細(xì)胞損傷。

4.3 CircRNA cANRIL與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)

全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)，INK4/ARF基因位點(diǎn)附近的9p21染色體的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與粥樣硬化性血管疾病有關(guān)，表明9p21.3染色體與粥樣硬化性血管疾病的易感性相關(guān)。Liu等[14]證實(shí)，粥樣硬化性血管疾病相關(guān)的9p21染色體SNP可以調(diào)控INK4/ARF的表達(dá)(INK4a：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4抑制劑；ARF：可變閱讀框)。CircRNA ANRIL(cANRIL)是來(lái)自INK4/ARF基因位點(diǎn)的反義轉(zhuǎn)錄物，INK4/ARF位點(diǎn)附近的9p21.3染色體上的SNP可通過(guò)調(diào)控ANRIL的剪接和cANRIL合成，調(diào)控INK4/ARF的轉(zhuǎn)錄。因此，INK4/ARF轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的選擇性剪接可影響cANRIL的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。由于cANRIL可通過(guò)PcG復(fù)合物招募影響PcG介導(dǎo)的INK4/ARF沉默，Burd等[17]推測(cè)，cANRIL的結(jié)構(gòu)修飾可使PcG介導(dǎo)的INK4/ARF沉默和動(dòng)脈粥樣硬化易感性改變。因此，cANRIL與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)程度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中hsa_circ_0003575表達(dá)上調(diào)，并在功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)揭示了hsa_circ_0003575沉默，在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的作用[18]。這些發(fā)現(xiàn)都將為動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷提供新的治療策略。

4.4 CircRNA Circ-Foxo3誘導(dǎo)心臟細(xì)胞的衰老表型

Circ-Foxo3衍生自轉(zhuǎn)錄因子Foxo3，是叉形頭轉(zhuǎn)錄因子家屬成員(Foxo)的circRNAs，其在老年小鼠和患者的細(xì)胞質(zhì)中高度表達(dá)[19]。研究證明，細(xì)胞中circ-Foxo3的高表達(dá)使細(xì)胞周期停滯在G1期，且不能進(jìn)入到S期。Du等[19]發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，且異位表達(dá)的circ-Foxo3與衰老相關(guān)蛋白ID1和E2F1以及應(yīng)激相關(guān)蛋白低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induced factor 1a，HIF1α)和黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)結(jié)合。由于HIF1α(應(yīng)激蛋白)和FAK(應(yīng)激蛋白)對(duì)衰老產(chǎn)生負(fù)面影響，細(xì)胞質(zhì)中circ-Foxo3的數(shù)量增加導(dǎo)致通過(guò)阻斷細(xì)胞質(zhì)中ID1、E2F1、HIF1α和FAK，抑制此類蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中的水平，促進(jìn)細(xì)胞的衰老表型，為抑制心臟衰老和心肌保護(hù)方面提供了潛在的新治療方法。

4.5 新發(fā)現(xiàn)

AKT是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，影響細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)錄和凋亡。PDK1(phosphoinositide dependent kinase 1)為3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1。兩者通常分布在細(xì)胞質(zhì)中，異位表達(dá)的circ-Amotl 1通過(guò)與AKT1和PDK1形成三元化合物，促進(jìn)AKT與PDK1的結(jié)合，誘導(dǎo)AKT磷酸化和pAKT核易位，增強(qiáng)細(xì)胞存活，抑制凋亡。CircRNA- circ-Amotl 1優(yōu)先表達(dá)在新生兒心臟組織中，異位表達(dá)circ-Amotl 1可提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比，多柔比星處理后小鼠心臟功能明顯降低，通過(guò)腹腔注射circ-Amotl 1促進(jìn)其表達(dá)，可治療甚至消除多柔比星的心臟毒性。在細(xì)胞核中，pAKT通過(guò)直接磷酸化正向調(diào)節(jié)增殖相關(guān)的因子、并負(fù)向調(diào)控促凋亡蛋白的表達(dá)[20]。外源性circ-Amotl1的表達(dá)可減少心肌細(xì)胞纖維重建，增加心肌細(xì)胞的抗凋亡能力，削弱多柔比星誘導(dǎo)的心肌纖維重建，對(duì)心功能起到保護(hù)作用。總之，這些都為心肌損傷修復(fù)提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略[21]。

5 展望

目前我們對(duì)circRNAs的了解和探索尚未成熟，與心血管疾病相關(guān)的circRNAs更是少之又少。相信我們會(huì)發(fā)現(xiàn)更多與心血管疾病相關(guān)的circRNAs及其作用機(jī)制，為心血管疾病診斷及治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)