建設(shè)具有中醫(yī)兒科學(xué)科特色的兒童肺系病癥生物樣本庫(kù)的思考

張秀英， 王雪峰， 仇明珂

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科成立于1958年，2002年獲批國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科、重點(diǎn)?？?，三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室-病毒實(shí)驗(yàn)室，2008年被評(píng)為國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？平M長(zhǎng)單位、國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地婦兒病研究基地及小兒肺炎毒熱證重點(diǎn)研究室。中醫(yī)藥防治小兒肺系病癥是本學(xué)科的主要研究方向。學(xué)科帶頭人王雪峰教授先后主持承擔(dān)了“十五”國(guó)家科技部攻關(guān)項(xiàng)目-小兒肺炎中醫(yī)證治規(guī)律研究(2001BA701A16a)及以小兒肺炎為示范建立辨證規(guī)范及中醫(yī)療效評(píng)價(jià)方法體系研究(2004BA721a05)，“十一五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目-中西醫(yī)結(jié)合綜合方案干預(yù)小兒肺炎療效評(píng)價(jià)研究(JDZX2012098)和“十二五”行業(yè)專項(xiàng)-兒童群體社區(qū)獲得性肺炎中醫(yī)綜合防治方案推廣應(yīng)用研究(201307007)等系列臨床科研項(xiàng)目?；A(chǔ)研究方面該學(xué)科主要致力于探索中醫(yī)藥干預(yù)肺炎支原體、流感病毒、呼吸道合胞病毒肺炎等。同時(shí)針對(duì)兒科臨床特點(diǎn)也對(duì)慢性咳嗽、反復(fù)呼吸道感染及哮喘等病種開展系列研究，在小兒肺系病癥臨床及科學(xué)研究方面奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步滿足臨床與科學(xué)研究的需要，深入研究?jī)和蜗导膊〉陌l(fā)病機(jī)制，探討有效的預(yù)警、早期診斷和臨床治療方案以降低發(fā)病率和病死率，因此提出了構(gòu)建具有學(xué)科特色兒童肺系病癥生物樣本庫(kù)的構(gòu)想，以其進(jìn)一步深化學(xué)科的內(nèi)涵建設(shè)。

1 生物樣本庫(kù)的建設(shè)現(xiàn)狀

生物樣本庫(kù)又稱生物銀行(Biobank)，主要是指收集和應(yīng)用健康及疾病生物體的生物分子、細(xì)胞、組織和器官等，包括人體器官、組織、體液或處理過的樣本(DNA、RNA、蛋白等)及其與這些樣本相關(guān)的臨床資料、質(zhì)控、管理等生物應(yīng)用系統(tǒng)[1]。一般由兩部分組成：一是樣本實(shí)體庫(kù)，即可以從中提取到DNA、RNA、蛋白質(zhì)等成分的組織或血液等生物樣本；二是樣本信息庫(kù)，包括從生物樣本中提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)等成分所得到的個(gè)人獨(dú)有的遺傳信息數(shù)據(jù)及臨床診療信息[2]。

美國(guó)從1987年開始就出現(xiàn)了專門的生物樣本資源庫(kù)，2001年歐洲生物樣本庫(kù)(Eurobiobank)建立，隨后，英國(guó)、奧地利、澳大利亞等國(guó)家也相繼建立了自己的生物樣本資源庫(kù)。亞洲地區(qū)的韓國(guó)、日本、新加坡均擁有自己的生物樣本庫(kù)網(wǎng)絡(luò)。我國(guó)生物樣本的收集開始于20世紀(jì)70年代。1994年由中國(guó)科學(xué)院建立了第一個(gè)中華民族永生細(xì)胞庫(kù)。隨后山東、北京、泰州、天津等也分別建立了相應(yīng)的生物樣本庫(kù)。中醫(yī)藥行業(yè)領(lǐng)域，生物樣本庫(kù)起步相對(duì)較晚。2010年湖北省中醫(yī)院在樣本庫(kù)建設(shè)方面做了初步的探索。經(jīng)過近幾年的發(fā)展，目前已具備一定的規(guī)模。

2 兒童肺系病癥生物樣本庫(kù)建設(shè)要點(diǎn)

具有完整臨床信息的高質(zhì)量的規(guī)范的生物樣本是樣本庫(kù)建設(shè)的核心內(nèi)容[3]。高質(zhì)量的樣本對(duì)于深入研究疾病以完善診療非常關(guān)鍵，而科學(xué)研究所得到的數(shù)據(jù)是否可靠則有賴于樣本在采集、處理及存儲(chǔ)等各階段嚴(yán)格的質(zhì)量控制[4-5]。主要包括一次樣本血液和組織樣本采集和處理，二次樣本的質(zhì)量控制及信息樣本的完整性等方面[6-7]。

2.1 規(guī)范一次樣本采集及處理 一次樣本的采集過程應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行樣本庫(kù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。血液樣本從采集到入庫(kù)的整個(gè)過程在2 h內(nèi)完成。用抗凝管和促凝管分別采集血液各1管，然后由專門的工作人員在最短的時(shí)間內(nèi)送至樣本庫(kù)，室溫放置30 min后，2 500g15 min離心，多管分裝(4小管，2大管)，短期存放的樣本保存在-80 ℃冰箱，長(zhǎng)期或者重要的樣本存放在液氮中，整個(gè)血樣處理過程在生物安全柜中完成。組織樣本在整個(gè)切取、轉(zhuǎn)運(yùn)、入庫(kù)過程都在低溫下進(jìn)行，組織樣本從熱缺血到完成分裝、入庫(kù)的整個(gè)過程，時(shí)間控制在30 min內(nèi)。組織樣本切除后，用無(wú)菌、無(wú)RNA酶的生理鹽水沖洗樣本，去除樣本上的黏液、血液。為了避免交叉污染，應(yīng)使用消毒滅菌后的器材。轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)需置于碎冰上，然后速凍在液氮中。

2.2 定期對(duì)二次樣本進(jìn)行質(zhì)檢 對(duì)樣本進(jìn)行抽檢是保證DNA/RNA及蛋白質(zhì)完整性的重要手段。應(yīng)采用隨機(jī)原則，以一定的比例，按照等距原則進(jìn)行隨機(jī)抽樣。每月隨機(jī)抽取2%的樣本，每年年初抽取0.1%的樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。DNA/RNA主要檢測(cè)DNA/RNA的濃度、純度及完整性。提取樣本中的DNA/RNA，然后用分光光度法檢測(cè)DNA/RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA/RNA的完整性。蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)可選擇特定的抗體，用Western Blot和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)檢測(cè)樣本中蛋白的相應(yīng)抗原或結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析來評(píng)估蛋白質(zhì)的質(zhì)量。肺組織樣本的質(zhì)量檢測(cè)主要采用蘇木精和伊紅染色方法評(píng)估。

2.3 實(shí)現(xiàn)管理體系制度化 首先建立數(shù)據(jù)庫(kù)管理制度，構(gòu)建科學(xué)合理的、高效的、易于維護(hù)的、專業(yè)化的樣本庫(kù)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，利用信息化技術(shù)實(shí)現(xiàn)樣本信息(患者資料、標(biāo)本資料、隨訪信息、反饋信息等)及樣本資源的完善保存與管理。其次制定生物樣本庫(kù)管理制度、儀器設(shè)備使用管理制度、樣本庫(kù)相關(guān)試劑管理制度及廢液廢物處置等制度，統(tǒng)一管理規(guī)范，從樣本的入庫(kù)到出庫(kù)每個(gè)環(huán)節(jié)均有相應(yīng)的規(guī)章制度，保證其有章可循。同時(shí)制定一套樣本質(zhì)量評(píng)估體系如定期隨機(jī)抽檢機(jī)制度等。再次依據(jù)存儲(chǔ)樣本的生物安全防護(hù)等級(jí)確立相應(yīng)生物安全管理制度。同時(shí)應(yīng)有消防安全、物理安全、化學(xué)安全、信息安全及危險(xiǎn)品管理等相關(guān)制度。最后制定實(shí)驗(yàn)室緊急疏散預(yù)案；水電事故應(yīng)急處理預(yù)案；火災(zāi)及液氮凍傷等應(yīng)急預(yù)案。

2.4 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)存儲(chǔ)條件 樣本存儲(chǔ)條件的穩(wěn)定是樣本質(zhì)量的基本保障。樣本庫(kù)應(yīng)配備自動(dòng)化溫控監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)室溫、低溫冰箱、超低溫冰箱、液氮罐進(jìn)行24 h持續(xù)監(jiān)控，監(jiān)測(cè)頻率應(yīng)為30 min 1次;如監(jiān)測(cè)參數(shù)有異常，系統(tǒng)將自動(dòng)報(bào)警并發(fā)送短信通知樣本庫(kù)工作人員，工作人員在1 h內(nèi)到達(dá)，現(xiàn)場(chǎng)處理并填寫意外。

2.5 保證信息的完整性 肺系病癥生物樣本庫(kù)的信息包含了基本臨床信息、隨訪信息、出入庫(kù)使用情況及課題應(yīng)用反饋數(shù)據(jù)。樣本庫(kù)的基本臨床信息包括樣本對(duì)應(yīng)的患者各項(xiàng)生化檢查、影像資料及治療情況;隨訪信息包括患者的疾病復(fù)發(fā)情況及預(yù)后等。完整的信息資料可為評(píng)估臨床治療方案提供最終標(biāo)準(zhǔn)，有助于診療方案的完善和改進(jìn);同時(shí)也是課題具備臨床意義的重要證據(jù)。

3 建設(shè)具有學(xué)科特色肺系病癥生物樣本庫(kù)的意義

生物樣本庫(kù)是眾多重要科研成果快速產(chǎn)業(yè)化、應(yīng)用到臨床、實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要保證。高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的生物樣本庫(kù)是疾病基礎(chǔ)與臨床研究、臨床診治技術(shù)研發(fā)、藥物研發(fā)、健康研究與產(chǎn)業(yè)化，即實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的最寶貴資源[8]。利用生物樣本進(jìn)行生命科學(xué)研究、進(jìn)而服務(wù)于臨床診療是生物樣本庫(kù)建設(shè)的最終目的[9-10]。依托兒童肺系疾病生物樣本庫(kù)信息樣本、一次樣本及二次樣本結(jié)合蛋白組學(xué)、基因組學(xué)及代謝組學(xué)探討肺系疾病相關(guān)中醫(yī)證候的微觀生物標(biāo)志物，從微觀層面揭示肺系疾病相關(guān)中醫(yī)證候的本質(zhì)特征。

通過采集和存儲(chǔ)的具有學(xué)科特色的兒童肺系病癥的生物樣本可支持相關(guān)病癥的國(guó)家和省市級(jí)課題的立項(xiàng)，完成學(xué)科的人才培養(yǎng)及梯隊(duì)建設(shè)。其研究結(jié)果可發(fā)表相關(guān)論文及專著，有利于學(xué)科開展廣泛的學(xué)術(shù)交流，提高學(xué)科學(xué)術(shù)建設(shè)水平。同時(shí)通過跨學(xué)科協(xié)作，如臨床醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)和倫理學(xué)等多學(xué)科的協(xié)作，可更好地推動(dòng)基礎(chǔ)和臨床研究的發(fā)展，深化學(xué)科建設(shè)內(nèi)涵，繼續(xù)保持本學(xué)科在國(guó)內(nèi)中醫(yī)兒科領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)地位。