結核分枝桿菌耐藥性檢測方法的研究進展

張俊仙 吳雪瓊

耐藥結核病，尤其是耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的診斷和治療是當前結核病防控面臨的重大難題。隨著分子生物學理論和技術的發(fā)展，結核分枝桿菌(MTB)耐藥分子機制逐步被闡明，建立于MTB耐藥相關靶基因突變檢測基礎上的分子藥物敏感性檢測(drug susceptibility test，DST)試劑盒也逐步問世，目前已能夠為臨床檢測下列靶基因突變：利福平(RFP)耐藥相關基因rpoB，異煙肼(INH)耐藥相關基因katG和inhA，鏈霉素(Sm)耐藥相關基因rpsl和rrs，乙胺丁醇(EMB)耐藥相關基因embB，氟喹諾酮類(FQ)藥物耐藥相關基因gyrA和gyrB，二線注射類抗結核藥物耐藥相關基因rrs，吡嗪酰胺(PZA)耐藥相關基因pncA。筆者對MTB的DST產品及新方法的研究進展進行概述。

一、獲得我國注冊證書的試劑盒

截至目前，經我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的國內外DST試劑有16個，其中進口試劑有5個，用于表型DST的有3個(BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)、Bact/ALERT 3D和分枝桿菌藥物敏感性檢測板Sensititre?MYCOTB)，用于分子DST的有2個(GeneXpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus)；國產試劑有11個，用于表型DST的有2個[分枝桿菌藥物敏感性檢測試劑盒(培養(yǎng)法)和MTB藥物敏感性試劑盒)，用于分子DST的有9個(包括DNA微陣列芯片法、PCR-線性探針雜交法、熒光PCR熔解曲線法和PCR-基因測序法等)，用于檢測RFP、INH、Sm、EMB和FQ等耐藥性。

(一)表型DST方法

1. BACTEC MGIT 960系統(tǒng)：于1997年由美國推出的集分枝桿菌快速生長培養(yǎng)、檢測及DST技術為一體的全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀。該儀器采用熒光法的原理，在培養(yǎng)管底部包埋有熒光顯示劑，直接感應培養(yǎng)管內氧氣濃度。當培養(yǎng)管內有分枝桿菌生長時，氧氣被消耗，熒光顯示劑在二極管的激發(fā)下發(fā)出熒光，熒光強度記憶探測器每隔60 min連續(xù)測定培養(yǎng)管內熒光強度，并通過數(shù)據處理得出陽性結果。陽性培養(yǎng)管取出后離心，沉淀物進行涂片抗酸染色以確定是否為分枝桿菌。涂片陽性管進一步進行表型液體DST比例法：每株MTB準備5支MGIT 960培養(yǎng)管，1管為生長對照管，加1∶100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5 ml；4管為加藥管，分別加入RFP、INH、Sm和EMB及菌懸液。放入BACTEC MGIT 960儀器，在4～13 d內根據生長指數(shù)自動報告耐藥或敏感結果。國內研究顯示，BACTEC MGIT 960檢測與改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法比較，檢測RFP、INH、Sm和EMB的耐藥結果符合率分別為91.62%～98.78%、97.55%～97.77%、93.86%～96.73%和94.97%～96.73%，具有很高的符合率(總符合率為94.55%～97.45%)[1-3]；但BACTEC MGIT 960 檢測的平均時間只需6.7～8 d，明顯短于改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法(平均時間26～42 d)。由上可知，兩種方法DST結果具有極高的可比性和高度的一致性，兩種方法在培養(yǎng)時間和DST時間上卻存在很大差異。雖然BACTEC MGIT 960大大縮短培養(yǎng)和DST時間，但是其試劑價格昂貴，現(xiàn)在國內實驗室基本是先用BACTEC MGIT 960進行培養(yǎng)，然后用改良羅氏培養(yǎng)基進行DST。

2. Bact/ALERT 3D：于1996年經美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，用于醫(yī)院及科研機構的細菌培養(yǎng)和鑒定的液體培養(yǎng)系統(tǒng)，是全自動非放射性的快速細菌培養(yǎng)系統(tǒng)。該儀器應用細菌在生長過程中產生CO2的原理，通過比色計傳感器和反射光連續(xù)自動監(jiān)測培養(yǎng)瓶底部的CO2變色指示劑的顏色變化，來顯示培養(yǎng)瓶內是否有細菌生長。當瓶內有分枝桿菌生長時，產生的CO2滲透至感應器，儀器可自動連續(xù)檢測，并自動顯示有無分枝桿菌生長。當3D系統(tǒng)顯示陽性時，按系統(tǒng)操作步驟提示：取出陽性瓶進行涂片抗酸染色，確認有抗酸桿菌后即進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。取原始分離瓶菌液，接種于預先配制好含有藥敏試驗所需標準藥物濃度的MB/BacT培養(yǎng)基和空白對照(藥敏試驗菌液需稀釋100倍)MB/BacT培養(yǎng)基中，置3D儀器內進行培養(yǎng)與監(jiān)測，根據分枝桿菌生長的情況對比判斷對該藥物的敏感性。42 d未見陽性者可報告陰性結果。整個檢測過程自動化程度高，操作簡便，并在一定程度上能消除實驗過程中人為因素導致的偏差。BacT/ALERT 3D法與改良羅氏培養(yǎng)基比例法(L-J比例法)比較，檢測RFP、INH、Sm和EMB耐藥性的符合率分別為92.00%～96.38%、95.43%～96.38%、78.00%～96.38%和95.43%～100.00%，具有很高的符合率(總符合率為96.38%～100.00%)[4-6]；但BacT/ALERT 3D法的平均檢測時間只需8.5～11.8 d，明顯短于L-J比例法(平均檢測時間為28.0～42.0 d)。

3.分枝桿菌藥敏檢測板Sensititre?MYCOTB：美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)基于微量肉湯稀釋法原理開發(fā)的分枝桿菌藥敏檢測板Sensititre?MYCOTB，可檢測12種一線和二線抗結核藥物[包括RFP、Rfb、INH、EMB、Sm、氧氟沙星(Ofx)、莫西沙星(Mfx)、阿米卡星(Am)、對氨基水楊酸(PAS)、乙硫異煙胺(Eto)、卡那霉素(Km)、環(huán)絲氨酸(Cs)]的耐藥性，只需10 d。其優(yōu)點是可獲得抗結核藥物的最低抑菌濃度(MIC)，為臨床提供更確切的耐藥信息；缺點是實際應用中某些藥物的MIC值不好判讀[7]。

4. 分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)：國內基于在液體培養(yǎng)基中進行微孔板DST(比例法)方法開發(fā)了多個產品，已獲得我國注冊證書，如珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司研發(fā)的分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(培養(yǎng)法)可檢測16種抗結核藥物[Sm、INH、RFP、EMB、利福噴丁(Rpt)、左氧氟沙星(Lfx)、Am、Cm、丙硫異煙胺(Pto)、對氨基水楊酸異煙肼(Pa)、Mfx、PAS、克拉霉素(Clr)、利福布汀(Rfb)、Km和氯法齊明(Cfz)][8]。鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的MTB藥敏試劑盒，用于檢測MTB對臨床常用的14種抗結核藥物的敏感性。包括14種一、二線抗結核藥物，主要通過氧化還原指示劑顏色變化顯示MTB是否生長，當指示劑由其氧化狀態(tài)的藍色轉變?yōu)檫€原狀態(tài)的粉色時，證明MTB的生長，從而判定菌株耐藥性，該法以顏色變化增加了視覺觀察判斷結果的敏感性[9]。

(二)分子生物學檢測方法

1. Xpert?MTB/RIF：MTB的rpoB基因和突變檢測試劑盒(實時熒光PCR法；商品名：Xpert?MTB/RIF，以半巢式PCR技術為基礎，針對rpoB基因81 bp的RFP核心區(qū)域設計了5個相互重疊的分子探針，以檢測MTB是否對RFP耐藥，另一探針以球芽孢桿菌為內對照，以判斷DNA擴增和檢測效率。該方法是全球唯一的一套將PCR檢測所需的樣品準備、DNA擴增和檢測3個步驟集于一體，在反應盒中自動化完成的PCR檢測系統(tǒng)?？紤]到大多數(shù)對RFP耐藥的MTB同時也對INH耐藥，因此，在一定程度上可以通過Xpert?MTB/RIF檢測出的RFP耐藥結果來判斷MTB也可能是MDR-MTB，Xpert?MTB/RIF檢測方法可以作為MDR-TB的一種初步篩查技術。以比例法藥敏試驗檢測結果為參照標準，Xpert?MTB/RIF檢測MTB對RFP耐藥的敏感度為86.80%～97.73%，特異度為95.30%～97.95%[10-12]。

2.GenoType?MTBDRplus：為德國Hain Lifescience公司開發(fā)的應用PCR-線性雜交酶顯色法檢測MTB及其耐藥基因的試劑盒。該方法的原理是MTB臨床分離株通過多重PCR擴增后，與預先固定在試紙條上的特異性探針反向雜交，通過檢測rpoB基因突變確定MTB對RFP的耐藥性，通過檢測katG和inhA基因確定MTB對INH的耐藥性。因此，該方法可以根據rpoB、katG和inhA基因檢測結果快速診斷患者是否為MDR-TB，只需要1～2 d的時間。GenoType?MTBDRplus與改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法比較，檢測MTB對RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為96.55%～100.00%和97.30%～100.00%，兩種方法的符合率為96.00%～99.31%；檢測MTB對INH耐藥性的敏感度和特異度分別為84.44%～92.00%和94.93%～100.00%，符合率為92.25%～96.00%；檢測MTB耐多藥的敏感度和特異度分別為84.81%～97.00%和81.48%～100.00%，符合率為90.70%～96.00%[13-16]。

3.MTB耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)：由解放軍第三O九醫(yī)院全軍結核病研究所研發(fā)、北京博奧生物有限公司注冊生產，通過檢測2種一線抗結核藥物RFP和INH的3個耐藥基因rpoB、katG和inhA啟動子來進行耐藥結核病的診斷。約95%的MTB菌株對RFP耐藥由rpoB基因突變所致。MTB的rpoB基因突變一般發(fā)生在一個高度保守的81 bp(第507～533位27個氨基酸密碼子)組成的區(qū)域內。約60%～80%的MTB菌株對INH耐藥由katG及inhA基因突變所致。根據這3個耐藥基因的特異性保守核酸序列，運用不對稱PCR技術設計末端標記有熒光分子的引物及寡核苷酸探針，PCR擴增后帶有熒光分子的DNA片段與芯片上的探針在一定條件下進行雜交反應，根據堿基互補配對原則，PCR擴增產物與探針形成穩(wěn)定的二級結構，通過芯片掃描儀掃描雜交后的芯片上特定位置的熒光信號，從而檢測出樣品的耐藥基因信息。其中，RFP耐藥相關基因rpoB基因檢測6個位點13種突變基因型。INH耐藥相關基因katG基因及inhA基因啟動子各檢測1個位點共3個突變基因型。該檢測方法可在獲得DNA后6 h內得到結果。以傳統(tǒng)MTB藥敏試驗L-J比例法作為參照標準，DNA微陣列芯片法檢測MTB對RFP耐藥的敏感度為83.30%～92.73%，特異度為98.19%～100.00%，與L-J比例法或絕對濃度法的一致率為91.25%～99.40%；檢測MTB對INH耐藥的敏感度為72.00%～87.50%，特異度為93.43%～100.00%，與傳統(tǒng)藥敏試驗的一致率為82.50%～98.80%；檢測MTB耐多藥的敏感度為82.35%～100.00%，特異度為97.30%～100.00%，與傳統(tǒng)藥敏試驗的一致率為96.38%～100.00%[17-19]。

4.結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊生產。該試劑盒應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對RFP耐藥突變[20]，通過在MTB包含rpoB基因81 bp的RFP耐藥決定區(qū)設計引物和探針，4條探針兩兩分布在不同的反應管內，分別標記不同熒光物質，4條探針完全覆蓋rpoB決定區(qū)的所有8l bp堿基，且相鄰探針末端有2～3個堿基的重疊，從而保證了所有位置的突變均可檢測。每個標本有2個反應管，每種突變檢測羧基熒光素(FAM)和四氯熒光素(TET)兩個通道熒光信號，即每個標本有4個通道的檢測結果。利用rpoB探針與rpoB基因PCR擴增的產物結合力的不同會導致熔解溫度(Tm)值的差異，標本的熔點與陽性對照的熔點均一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型；4個通道任一通道中標本的熔點低于陽性對照2℃及以上時判定為突變型，根據熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實現(xiàn)對野生型與突變型的檢測。以傳統(tǒng)藥敏試驗L-J比例法或絕對濃度法或BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗為參照標準，熒光PCR熔解曲線檢測MTB對RFP的敏感度為90.00%～95.83%，特異度為93.90%～97.42%，符合率為93.00%～99.00%[20-23]。

5.結核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊生產。該試劑盒應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對INH耐藥突變[20]，在MTB的INH靶基因的擴增階段設計了5條分別標記不同熒光物質的探針，其中A管3條探針覆蓋ahpC啟動子區(qū)-44～-30位點、inhA94密碼子突變和-15～-3位點；B管的2條探針主要檢測inhA啟動子區(qū)-17～-8位點和katG315密碼子突變。每個標本有2個反應管，每種突變檢測FAM和TET兩個通道熒光信號，即每個標本有4個通道的檢測結果。標本的熔點與陽性對照的熔點均一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型；4個通道任一通道中標本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時判定為突變型。根據熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實現(xiàn)對野生型與突變型的檢測。以傳統(tǒng)藥敏試驗(L-J比例法)或絕對濃度法或BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗為參照標準，應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對INH耐藥的敏感度為80.00%～87.69%，特異度為94.59%～96.40%，符合率為90.70%～97.00%[20，22-24]。

6.結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊生產，應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對Sm耐藥突變。MTB對Sm耐藥的產生是由于核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16S核糖體RNA編碼基因(rrs)突變所致，70%以上的基因突變發(fā)生在rpsL43位點。本試劑盒針對rpsL43、rpsL88、rrs513～517和rrs905～908等4個區(qū)域進行檢測，可以檢測到在這4個區(qū)域發(fā)生突變的全部菌株[25]。檢測時每個標本有兩管在雙色實時PCR儀器進行。一管檢測rpsL43、rpsL88密碼子基因突變，另一管檢測rrs513～517位點和rrs905～908位點基因突變，每種突變檢測FAM和TET兩個通道熒光信號，即每個標本有4個通道的檢測結果。當標本的熔點與陽性對照的熔點均一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型；4個通道任一通道中標本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時判定為突變型。根據熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實現(xiàn)對野生型與突變型的檢測。與L-J比例法為參照標準，應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對Sm耐藥的敏感度為78.60%～88.46%，特異度為80.95%～97.35%，符合率為81.82%～94.42%[25-27]。

7.結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊生產，應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對EMB耐藥突變。檢測分兩管在雙色實時PCR儀器進行，每個標本有2個反應管，一管檢測embB306和embB497位點基因突變，另一管檢測embB378～380和embB406位點基因突變，每種突變檢測FAM和TET兩個通道熒光信號，每個標本有4個通道的檢測結果，完成4個常見突變位點上所有突變類型的檢測[22]。當標本的熔點與陽性對照的熔點均一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型；4個通道任一通道中標本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時判定為突變型。根據熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無。以L-J比例法為參照標準，應用熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對EMB耐藥的敏感度為81.97%～88.64%，特異度為75.76%～96.66%，符合率為80.91%～94.17%[25-27]。

8.結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊生產。該試劑盒基于探針熔解曲線分析的原理，以gyrA為靶基因序列進行PCR擴增，擴增體系內含有FAM標記的gyrA基因88～99位核苷酸密碼子的熒光探針。在PCR擴增中產生大量靶基因序列，靶序列與探針雜交，雜交產物產生特定的熔點，通過靶序列熔點的變化，判斷MTB菌株對FQ藥物的耐藥情況。由于MTB的gyrB基因的突變率非常低，本試劑盒沒有涉及。以7H10瓊脂培養(yǎng)基比例法或Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基比例法為參照標準，熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對FQ藥物耐藥性的敏感度、特異度、符合率分別為96.2%～97.01%、97.6%～99.55%和97.0%～99.21%[28-29]。

9.結核分枝桿菌利福平耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)：由亞能生物技術(深圳)有限公司注冊生產。反向點雜交技術是Saiki等在1989年發(fā)明的，主要用于檢測引起細菌耐藥的基因突變。PCR-反向點雜交法是近年發(fā)展起來的集DNA探針、核酸雜交和酶聯(lián)顯色三大技術于一體的新型基因診斷技術，用已標記的RFP耐藥相關rpoB基因的PCR擴增產物與固定在固相膜上未標記的相應寡核苷酸探針雜交的核酸分子雜交的方法檢測rpoB基因3個位點6個基因型的突變。以L-J比例法為參照標準，應用該方法檢測MTB對RFP耐藥的敏感度為79.66%～94.90%，特異度為91.84%～100.00%，符合率為87.26%[30-31]。

10.結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變檢測試劑盒(PCR-測序法)：由中山大學達安基因股份有限公司注冊生產，用于對MTB復合群的分離培養(yǎng)物進行INH耐藥突變檢測，檢測位點包括katG基因的315位點(AGC→ACC)和inhA基因啟動子區(qū)-15位點(C→T)的突變。

11.結核分枝桿菌利福平耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-Sanger測序法)：由中山大學達安基因股份有限公司注冊生產，可用于檢測MTB分離株對RFP耐藥的rpoB基因第507～533中具有明確耐藥的531(TCG→TTG)、526(CAC→TACCGC)、516(GAC→GTC)位密碼子突變。

二、在國際上獲得注冊證書但尚未進入我國的試劑盒

1. GenoType?MTBDRsl： GenoType?MTBDRsl技術原理同GenoType MTBDRplus，都是基于PCR-線性探針雜交檢測。2009年，德國Hain Lifescience公司推出了二線抗結核藥物耐藥快速診斷試劑盒GenoType?MTBDRsl 1.0版，可同時快速檢測EMB、FQ、Am、Km和Cm常見耐藥基因型，如可以檢測FQ類藥物(如Ofx和Lfx)耐藥相關基因gyrA、氨基糖苷類抗生素(如Km、Am)耐藥相關基因rrs和EMB耐藥相關基因embB的突變。穆成等[32]報道GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測MTB對Ofx耐藥性的敏感度和特異度分別為83.3%和95.4%，與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗結果具有較高的一致性。Barnard等[33]報道，以BACTEC MGIT 960培養(yǎng)藥敏試驗為參照標準，GenoType MTBDRsl線性探針實驗檢測MTB對Ofx、Am耐藥和XDR-TB的敏感度分別為90.7%、100.0%和92.3%，特異度分別為98.1%、99.4%和99.6%。而2.0版試劑盒除了能檢測1.0版的gyrA和rrs基因，還能檢測gyrB和eis啟動子基因突變；由于EMB耐藥基因檢測的敏感度低，2.0版試劑盒不包括EMB耐藥性檢測。2016年5月2.0版試劑盒雖被WHO推薦，但尚未獲得我國醫(yī)療器械注冊證書。

2. Genedrivet?Assay：Genedrivet?Assay試劑盒可以檢測MTB對RFP的耐藥性。其以rpoB基因位于81 bp的核心區(qū)域設計引物和探針，檢測516、526和531位的突變。檢測原理是用一種簡單的紙基DNA提取方法，結合不對稱PCR和專有的雜交探針技術，獲得基因型信息。Castan等[34]報道，用已知數(shù)量的MTB液體培養(yǎng)物制成的模型樣品，Genedrivet?Assay檢測MTB對RFP耐藥性的總敏感度為72.3%(95%CI：59.8%～82.7%)；對于菌量>1000菌落形成單位(CFU)/ml的樣品，檢測敏感度為85.7%；而對于菌量<100 CFU/ml的樣品，檢測敏感度為65.9%；檢測MTB對RFP的耐藥性的特異度為100.0%(95%CI：83.2%～100.0%)。對于臨床痰液標本用同樣的方法處理，顯示出與模型數(shù)據具有良好的一致性。用Genedrivet?Assay 檢測涂片樣本稀少或涂片陰性的結核病患者的效能與GeneXpert MTB/RIF相當[34]。

3. REBA MTB-Rifa?Assay：由韓國注冊生產的一種基于反向雜交原理的線性探針實驗，其原理是將特定的寡核苷酸探針固定在膜上，并在嚴格控制的條件下與生物素標記的PCR產物雜交。該方法由8個探針組成，其中5個探針橫跨RFP耐藥決定區(qū)的野生型rpoB序列，它們構成了最常見的特異性突變。Cho等[35]報道，以L-J比例法為參照標準，在492株MTB臨床分離株中，REBA MTB-Rifa?檢測MTB對RFP耐藥的敏感度和特異度分別為98.1%(211/215)和100.0%(277/277)；對228例涂陽患者痰標本，REBA MTB-Rifa?檢測MTB對RFP耐藥的敏感度和特異度分別為100.0%(96/96)和100.0%(132/132)。

三、臨床前研究的新方法

1.多重連接依賴式探針擴增技術(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)：由荷蘭科學家Schouten等于2002年首次報道，是一種高通量、針對待測核酸中的靶序列進行定性、定量的分析。該方法只需20 ng/μl DNA即可通過簡單的雜合、連接、PCR擴增及電泳步驟，可在同一反應管中檢測多達50個位點的拷貝數(shù)變異，具有高通量、高效率、低成本及自動化程度高等優(yōu)點，在國內主要用于產前診斷、腫瘤和動物疫病等方面的檢測。近幾年，國外將該技術用于檢測結核病，但在國內還未見此方面應用的報道。MLPA技術原理主要包括：樣品DNA變性、探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴增和結果的檢測分析。其操作只需要一臺基因擴增儀和序列電泳系統(tǒng)，耗時在24 h以內。Santos等[36]報道，以PCR產物直接測序為參照標準，MLPA和Genotype?MTBDRplus檢測MTB對INH耐藥的敏感度分別為92.8%和85.7%，特異度分別為100.0%和97.5%；對RFP耐藥的敏感度分別為87.5%和100.0%，特異度分別為100.0%和98.8%，結果表明兩種分子檢測方法均可用于快速檢測耐藥結核病，且具有較高的準確性。

2.多色熒光實時定量PCR (multi-fluorescence quantitative real-time PCR，MF-qRT-PCR)：根據MTB耐藥突變數(shù)據庫報道和測序結果中的耐藥突變的關鍵位置和頻率設計用4種熒光標記的10個探針檢測rpoB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因的突變[37]。以L-J比例法為參照標準，MF-qRT-PCR檢測MTB對RFP耐藥的敏感度和特異度分別為94.6%和100.0%，檢測MTB對INH耐藥的敏感度和特異度分別為85.9%和95.3%；以PCR產物直接測序為參照標準，MF-qRT-PCR檢測MTB對RFP耐藥的敏感度和特異度分別為97.2%和100.0%，檢測MTB對INH耐藥的敏感度和特異度分別為97.9%和96.4%。

3. PCR-比色法：PCR-酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗(enzyme-linked oligosorbent assay，ELOSA)是一種低成本的基于DNA探針的比色測定方法，用于MTB對RFP耐藥性的檢測[38]。其根據RFP基因序列設計rpoB引物，rpoB基因片段通過PCR用地高辛標記，將擴增的產物與選擇的等位基因特異性雜交，并將其捕獲到涂有鏈霉親和素的微量滴定板上，通過比色進行檢測。所有探針的檢測敏感度和特異度均≥96%。

4.數(shù)字PCR：數(shù)字PCR可以檢測耐藥MTB中的異質耐藥性[39]。應用雙TaqMan-MGB探針檢測katG(315)、rpoB(531)、gyrA(94，95)和rrs的野生型和突變型序列，這些基因分別與INH、RFP、FQ和氨基糖苷耐藥相關。數(shù)字PCR方法能夠檢出MTB混合物中千分之一含量的耐藥菌。相比之下，實時PCR或普通PCR檢測的敏感度低，在MTB混合物中需含10%～50%的耐藥菌方能檢出。

5.焦磷酸測序：焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是1987年由Nyren等發(fā)展起來的一項全新的短片段DNA測序技術，可以準確、快速地測定一段較短的DNA片段，其檢測精確性可與傳統(tǒng)的Sanger雙脫氧鏈終止法相媲美，且操作極為簡便。鄭瑞娟等[40]報道應用焦磷酸測序技術，測定150株MTB臨床分離株rpoB基因81 bp的RFP抗藥性決定區(qū)(RRDR)，分析rpoB基因突變特點，與絕對濃度法的符合率是92.7%，與MIC法的符合率是97.8%。

6.全基因組測序(WGS)：該方法與現(xiàn)有的分子檢測方法相比，可準確地提供更多的信息，識別各種遺傳多態(tài)性，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、小片段插入和缺失。目前WGS檢測MTB對RFP和INH耐藥性的分析性能特征較高，檢測RFP耐藥的敏感度和特異度分別為98%(95%CI：93%～98%)和98%(95%CI：98%～100%)；檢測INH耐藥的敏感度和特異度分別為97%(95%CI：94%～99%)和93%(95%CI：91%～96%)；檢測其他藥物(Sm、EMB和PZA)耐藥的性能特點差異很大，對FQ耐藥的分析性能優(yōu)于氨基糖苷類和環(huán)肽類藥物[41]。未來通過采用分散測序、集中分析模型和半自動生物信息學管道，實現(xiàn)基于端到端的結核病診斷系統(tǒng)，這對患者在臨床治療期間可靠地預測藥物敏感性具有重要意義，也為耐藥結核病患者的臨床管理提供了新的方法。

四、結語

MTB耐藥性嚴重影響結核病的治療，引起耐藥的分子機制主要是藥物靶基因的改變。盡管現(xiàn)在已經有多種方法用來檢測藥物的耐藥性，但各有局限性，目前快速耐藥檢測主要是采用分子生物學的方法，但可檢測的抗結核藥物有限，而表型DST方法雖需較長檢測時間,但可了解MTB對較多抗結核藥物的耐藥性,兩類方法相互結合,取長補短,共同應用于臨床,指導結核病化療方案的制定。隨著科學技術的發(fā)展,相信會不斷研發(fā)出新的耐藥檢測技術,推廣應用于臨床,以解決當前仍存在的問題。