周 疆,鄭凱妮,朱 斐
(浙江農(nóng)林大學 動物科技學院,浙江 杭州311300)
中草藥(Chinese herb medicine)包括中藥和草藥,是一個組合名詞[1],中藥源于草藥,草藥是中藥的補充。中醫(yī)理論認為中草藥是人類在自然界中發(fā)現(xiàn)并直接供藥用的植物、動物、礦物以及基本不改變其理化屬性的簡單加工品。相比西藥,中草藥毒副作用小,不易產(chǎn)生抗藥性,環(huán)保性好;其中某些藥物成分不僅抗菌抗病毒,還具有免疫促進作用,能夠顯著地增強動物的抗病能力,改善動物的免疫機能[2]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化以及各類病害的頻繁發(fā)生,越來越多的環(huán)保監(jiān)測不合格水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)面臨停業(yè)整頓或關閉;農(nóng)業(yè)部公布的禁用漁藥品種逐年增多[3],化學藥物和抗生素的禁用范圍也逐年擴大。水產(chǎn)動物病毒疫苗的匱乏和中草藥在治療病毒性、自身免疫性和營養(yǎng)代謝性疾病上的作用,促使綠色安全的中草藥成為當前魚藥研究和開發(fā)的重點。中草藥飼料添加劑的研究起步較晚,在水產(chǎn)動物病害日益增多、環(huán)境保護和食品安全壓力不斷加大的今天,中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治方面所起的作用日益凸顯;傳統(tǒng)的復方中草藥制劑成份復雜,成本較高,作用機制不夠清楚,難以滿足現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的需要,由此單一中草藥及其提取物在水產(chǎn)動物免疫中的應用研究成為當前水產(chǎn)動物中草藥免疫的主要方向。
中草藥中含有甙類、有機酸類、多糖類、生物堿、鞣質和黃酮類等有效成分,對水產(chǎn)動物機體的抗病原微生物活性、免疫功能、生產(chǎn)性能有促進作用。中草藥飼料添加劑[4]以中草藥為飼料添加劑,副作用小,殘留物少,不產(chǎn)生環(huán)境污染,沒有抗藥性,不激發(fā)藥源性疾??;天然結構和生物活性較為完整,動物體更容易接受,因而促生長、調節(jié)新陳代謝、提高抗逆性和抗病性等作用較為明顯。伴隨著各項法律法規(guī)的出臺,社會對食品安全的日益重視和越來越多的化學物質的禁用,使得具備綠色安全等特質的中草藥逐漸替代化學合成藥物和植物生長調節(jié)劑成為新興的飼料添加劑。
中草藥對病毒的直接抑制作用主要是通過其免疫活性物質抑制病毒感染增殖過程中的某一個環(huán)節(jié)實現(xiàn)。WANG等[5]通過細胞試驗發(fā)現(xiàn):從綠茶提取物中得到的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)能阻斷草魚Ctenopharyngodon idellus呼腸孤病毒(respiratory enteric orphan virus)與細胞的層粘連蛋白受體結合,從而抑制草魚呼腸孤病毒感染草魚腎細胞。WANG等[6]用EGCG處理感染白斑綜合癥病毒(WSSV)的擬穴青蟹Scylla paramamosain,攻毒實驗結果發(fā)現(xiàn)1.00 mg·kg-1EGCG能抑制病毒復制,顯著增強擬穴青蟹抗WSSV感染的能力,其存活率顯著提高。黃芪Radix astragali,金銀花Lonicerae japonica及板藍根Isatidis radix等對病毒的復制也有顯著的抑制作用[7]。
中草藥除了能直接抑制病毒復制以外,還可以通過誘發(fā)機體產(chǎn)生干擾素或提高機體的非特異性免疫水平以達到抑制病毒感染的目的。HAETRAKUL等[8]發(fā)現(xiàn)在鯉魚Cyprinus carpio感染鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)前后注射0.99 g·L-1的扭序花Clinacanthus nutans葉片提取物均具有顯著的抗病毒作用。BALASUBRAMANIAN等[9]用印度木橘Aegle marmelos,苦瓜Momordica charantia和狗牙根Cynodon dactylon的提取物作為免疫增強劑喂養(yǎng)斑節(jié)對蝦Penaeus monodon,表明攻毒實驗對抵抗對蝦白斑綜合癥作用較強,其中使用100.00 mg·kg-1的狗牙根水提取物喂食后攻毒存活率可達100%。進一步研究[10]發(fā)現(xiàn):狗牙根水提取物對對蝦白斑綜合癥病毒抑制作用較強,飼料中添加20.00 g·kg-1的水提取物粉末,斑節(jié)對蝦攻毒試驗成活率可達 100%。RAMESHTHANGAM等[11]以添加 200.00和 300.00 g·kg-1水黃皮Pongamia pinnata葉片乙醇提取物粉末的飼料投喂斑節(jié)對蝦,飼喂11 d后,白斑綜合癥病毒(WSSV)攻毒成活率可達40%和80%。YOGEESWARAN等[12]用對蝦白斑綜合癥病毒感染斑節(jié)對蝦,用添加印度人莧Acalypha indica,狗牙根,胡黃連Picrorhiza scrophulariiflora,南非醉茄Withania somnifera和生姜Zingiber officinale等提取物作為免疫增強劑喂食,5 d后未添加免疫增強劑的全部死亡,而投喂添加草本免疫增強劑的飼料5,30和60 d,成活率分別為30%,50%和60%。DIREKBUSARAKOM等[13]發(fā)現(xiàn)扭序花葉片提取物可有效防治斑節(jié)對蝦黃頭病,添加量為1.00 g·kg-1防治效果最好。由此證實中草藥可以有效幫助蝦蟹抵抗WSSV感染。
一些中草藥對病原細菌存在一定的直接殺滅或抑制作用,如黃芪,黃芩Scutellaria baicalensis,金銀花,地錦草Euphorbia humifusa,蒲公英Taraxacum mongolicum,穿心蓮Andrographis paniculata,板藍根,五倍子Galla chinensis,大蒜Allium sativum,杜仲Eucommia ulmoides,甘草Glycyrrhiza uralensis等。SYAHIDAH等[14]研究發(fā)現(xiàn)檳榔Piper betle葉提取物對芽孢桿菌Bacillus,屎腸球菌Entrococcus feacalis,金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus,無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae,嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila,大腸埃希菌Escherichia coli,肺克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae,綠濃桿菌Pseudomonas aeruginosa和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus等9種魚類病原菌均有較強的抑制作用。SHEIKHLAR等[15]對檸檬Citrus limon,飛揚草Euphorbia hirta和葫蘆巴Trigonella foenum-graecum進行了體外抗菌實驗,發(fā)現(xiàn)飛揚草的甲醇提取物與其他草藥相比具有較大的抑制效果和最低抑制濃度。
除了直接的體外抑菌效果以外,中草藥還具有調節(jié)腸道內(nèi)菌群結構的作用,尤其是降低有害病菌的數(shù)量。羅琳等[16]給草魚分組投喂了添加了5.00,10.00和20.00 g·kg-1穿心蓮的飼料,試驗的第1,4,7,14,21,28天取樣檢測腸內(nèi)菌群的種類和數(shù)量,發(fā)現(xiàn)穿心蓮并不會影響腸內(nèi)大部分優(yōu)勢菌群的生長,但是當餌料添加量為l0.00和20.00 g·kg-1時,氣單胞菌的數(shù)目明顯減少。劉紅柏等[17]報道,將黃芪,茯苓Wolfiporia extensa,黃芩,板藍根及魚腥草Houttuyniae cordata等5種中草藥添加在飼料中投喂鯉魚,可以明顯改變鯉魚腸道細菌數(shù)量及組成,尤其可以增加腸道里的有益菌群,有效限制大部分條件致病菌的滋生。腸道內(nèi)有益菌群占優(yōu)勢能有效防治致病菌引起的各種疾病尤其是細菌性腸炎,而該病是導致魚類大量死亡的重要疾病。
中草藥能有效提高魚類溶菌酶活性和血細胞吞噬活性,預防和治療如嗜水氣單胞菌,溶藻弧菌,發(fā)光桿菌Photobacterium,鏈球菌Streptococcus,遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda,柱狀黃桿菌Flavobacterium columnare等細菌性疾病。羅慶華[18]將杜仲葉研磨成粉添加在鯉魚飼料中,投喂1個月后,鯉魚的免疫應答水平有效提高,對嗜水氣單胞菌的抗感染的能力顯著增強;添加量為40.00和60.00 g·kg-1的抗菌效果最好的。ARDó等[19]將黃芪和金銀花單獨或一同增添在尼羅羅非魚Oreochromis niloticus的飼料中均可以顯著提高血細胞的吞噬活性,單施或共用2種中草藥添加劑均可以降低感染嗜水氣單胞菌后的死亡率。DHAYANITHI等[20]給感染溶藻弧菌的黑雙帶小丑魚Amphiprion sebae投喂質量分數(shù)10,20,40 g·kg-1海欖雌Avicennia marina葉提取物的飼料,發(fā)現(xiàn)存活率分別為 70%,80%和85%,而對照組的存活率只有10%。CHOI等[21]發(fā)現(xiàn)1.00 g·kg-1韓國槲寄生Viscum coloratum提取物可顯著增強日本鰻鱺Anguilla japonica的非特異性免疫功能,提高受到嗜水氣單胞菌感染的鰻鱺的溶菌酶活性,同時提高存活率至80%。KAKOOLAKI等[22]發(fā)現(xiàn)使用200.00 mg·kg-1的茶Camellia sinensis提取物可提高鯔魚Mugil cephalus的血液免疫指標和溶菌酶活性,增強鯔魚對發(fā)光桿菌Photobacterium damselae感染的抵抗力。SUKUMARAN等[23]將8.00 g·kg-1的生姜添加到飼料中喂飼野鯪Labeo rohita,發(fā)現(xiàn)可顯著提高其溶菌酶活性和對嗜水氣單胞菌感染的抵抗力。WU等[24]研究發(fā)現(xiàn)苦參Sophora flavescens能促進尼羅羅非魚的非特異性免疫反應,尤其可提高血清溶菌酶活性,顯著增強對鏈球菌的抗病能力。NGUGI等[25]發(fā)現(xiàn)刺蕁麻Urtica dioica對魚的免疫功能有影響;用添加了刺蕁麻的飼料投喂魚,血漿皮質醇、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇等血清學指數(shù)降低,而總蛋白、白蛋白等隨著刺蕁麻添加量的增加而增加;當添加量為50.00 g·kg-1時魚嗜水氣單胞菌攻毒成活率高達95%。GOBI等[26]使用番石榴Psidium guajava葉提取物喂飼羅非魚Oreochromisspp.,提高了非特異性細胞免疫(過氧化物酶活性、活性氧活性和活性氮活性)和體液免疫(蛋白酶活性、補體活性、溶菌酶活性和堿性磷酸酶活性),并顯著降低了羅非魚感染嗜水氣單胞菌后的死亡率。TANG等[27]對尼羅羅非魚使用黃芪,當歸Angelicae sinensis,山楂Crataegus,甘草根和金銀花組成的中藥合劑來研究對免疫反應和抗病能力的影響,嗜水氣單胞菌攻毒試驗發(fā)現(xiàn):相比于對照組,試驗組的死亡率明顯降低。姜蕾等[28]以含5.00和10.00 g·kg-1的五倍子藥餌飼喂鯉魚,測定鯉魚肝臟的酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性發(fā)現(xiàn):五倍子添加劑可以有效預防鯉魚的細菌性敗血癥。RATTANACHAIKUNSOPON等[29]發(fā)現(xiàn)積雪草Centella asiatica提取物可以顯著提高尼羅羅非魚對柱狀黃桿菌的抗菌活性。HARIKRISHNAN等[30]發(fā)現(xiàn)投喂黃芩后條石鯛Oplegnathus fasciatus的免疫指標顯著上升,遲緩愛德華氏菌引起的死亡有效降低。MOHAMMED等[31]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加黑種草Nigella sativa的種子粉(50.00 g·kg-1)或種子油提取物(50 g·kg-1)均能有效增強斑點叉尾鮰Ietalurus punetaus抗柱狀黃桿菌感染的能力,并使感染后的死亡率從70%降低至18%。
除了魚類,中草藥還能提高其他水產(chǎn)動物的免疫力(如血細胞吞噬活性和酶活性),以抵抗細菌感染,減少死亡。NG′AMBI等[32]發(fā)現(xiàn)了皂苷對三疣梭子蟹Portunus trituberculatus有免疫刺激作用,可提高吞噬活性、血細胞總數(shù)、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,增強三疣梭子蟹對溶藻弧菌免疫防御力。陳超然等[33]發(fā)現(xiàn):添加35.00 mg·kg-1甘草素的飼料喂飼,能顯著提高中華鱉Trionyx sinensis抗嗜水氣單胞菌感染的能力。YEH等[34]發(fā)現(xiàn)臺灣牛樟Cinnamomum kanehirae葉和枝的精油或水提取物可以使凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei產(chǎn)生顯著的抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用,其中牛樟枝水提取物可降低凡納濱對蝦對溶藻弧菌的敏感程度,大幅提高酚氧化酶活性和血細胞吞噬活性。HSIEH等[35]發(fā)現(xiàn)注射香椿Toona sinensis提取物蘆丁能顯著提高凡納濱對蝦的酚氧化酶活力并有效降低溶藻弧菌攻毒后的凡納濱對蝦死亡率。MUSTHAFA等[36]研究發(fā)現(xiàn)飼料中增添喜來芝可使羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii的酚氧化酶和超氧化物歧化酶的活性顯著增加,并在嗜水氣單胞菌攻毒后顯著降低羅氏沼蝦的死亡率。
一些過去常用的水產(chǎn)用殺蟲劑,如化學藥劑類的呋喃唑酮和敵百蟲,抗生素類的阿維菌素等都被證實會對環(huán)境造成污染和危害[37-38]。雖然水產(chǎn)養(yǎng)殖中寄生蟲病害時有發(fā)生,但是將中草藥應用于抗寄生蟲的研究報道仍較少。
車輪蟲Trichodina是常見的水產(chǎn)動物寄生蟲,吳偉等[39]將印楝Azadirachta indica中提取的印楝素添加至斑馬魚Daino rerio餌料,發(fā)現(xiàn)對斑馬魚的48和96 h的半數(shù)致死質量濃度值分別是41.90和23.30 mg·L-1;作為中低毒魚藥,印楝素對魚的安全濃度≤2.30 mg·L-1;進一步研究表明:在安全濃度范圍內(nèi)印楝素對車輪蟲具有較強的滅殺效果。張繼平等[40]用超聲法提取苦參中的生物堿,發(fā)現(xiàn)浸泡用藥可以有效的驅殺鱖魚Siniperca chuatsi鰓部寄生的車輪蟲,表明苦參所含有的生物堿對車輪蟲有驅殺作用。王永[41]從苦豆子Sophora alopecuroides總堿中分離出槐果堿單體,灌胃給藥發(fā)現(xiàn)槐果堿可以有效殺滅小白鼠腸道內(nèi)寄生的線蟲Caenorhabditis elegans,這一研究成果為中草藥防治線蟲病提供了有益的參考。王玉群[42]發(fā)現(xiàn)苦楝Meliae cortex皮,苦參,博落回Macleaya cordata和仙鶴草Agrimoniae herba粗提取物可以有效殺滅草魚錨頭鳋Lernaea ctenopharyngodontis的無節(jié)幼體,24 h內(nèi)的殺蟲活性表現(xiàn)為苦參>仙鶴草>博落回>苦楝皮。指環(huán)蟲Dactylogyrus ctenopharyngodonid和小瓜蟲Lchthyophthirius multifiliis是淡水魚的2種重要寄生蟲,共同感染導致魚類死亡率較高; FU等[43]發(fā)現(xiàn)用添加4.00 mg·L-1的黃芪,大蒜,桑Morus alba葉和甘草的復方中草藥的飼料喂飼后,草魚血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性顯著增強,指環(huán)蟲和小瓜蟲的平均強度均明顯下降;合并4.00 mg·L-1生姜浴后,所有的寄生蟲在28 d內(nèi)被清除。刺激隱核蟲Cryptocaryon irritans是20多種海水養(yǎng)殖魚類的主要寄生蟲,使海水魚類養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟損失。劉婷婷[44]比較分析了檳榔,苦參,大黃Rheum palmatum,貫眾Cyrtomium fortunei,黃芩,川楝子Toosendan fructus等15種中草藥對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體和幼蟲的離體殺滅效果,當檳榔的藥物質量濃度為4.55 g·L-1時,在110 min內(nèi)即可殺滅滋養(yǎng)體和幼蟲;當大黃、貫眾、黃連Coptis chinensis和苦參的藥物質量濃度為9.09 g·L-1時,在150 min內(nèi)對滋養(yǎng)體和幼蟲具有殺滅效果,殺蟲活性表現(xiàn)為苦參>大黃>黃連>貫眾;當藥物質量濃度為18.18 g·L-1時,黃芩、川楝子、野菊Dendranthema indicum花和枳殼(酸橙Citrus aurantium果實制成)需要183 min才能殺滅滋養(yǎng)體和幼蟲,而黃芪等其他6種中草藥殺滅刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果不顯著。實驗結果表明檳榔、苦參、大黃、貫眾和黃連對刺激隱核蟲的殺蟲效果較為顯著,黃芩、枳殼、川楝子和野菊花對刺激隱核蟲具有一定的殺蟲效果。
中草藥能顯著提高魚類的特異性和非特異性免疫水平,大大減少魚類患病的概率。BAHI等[45]發(fā)現(xiàn)投喂葫蘆巴種子后金頭海鯛Sparus aurata體液免疫參數(shù)顯著提高,免疫相關基因特別是IgM基因在頭腎的表達顯著增強。HOSEINIFAR等[46]研究發(fā)現(xiàn)將白梭梭Haloxylon persicum用作為添加劑投喂鯉魚,可使鯉魚的一些免疫指標,如免疫球蛋白、溶菌酶、蛋白酶和補體活性等顯著升高,免疫指標在皮膚黏液中的提升比在血清中更明顯;與此同時鯉魚的增質量、最終體質量、飼料轉化率和特定生長率等生長指標也顯著提高。陳孝煊等[47]在飼喂異育銀鯽Carassius auratus gibelio的餌料中分別添加了10.00 g·kg-1的大黃、穿心蓮、板藍根和金銀花的水提取物,投喂4周后發(fā)現(xiàn)各組白細胞吞噬活性、體表黏液和血清中溶菌酶活性均顯著提高。YUNIS-AGUINAGA等[48]發(fā)現(xiàn)卡姆果Myrciaria dubia可使尼羅羅非魚對嗜水氣單胞菌的免疫反應顯著增強,包括溶菌酶活性、呼吸爆發(fā)活性、血清殺菌活性、白細胞總數(shù)和直接凝集作用等。SAFARI等[49]發(fā)現(xiàn)飼料中添加阿魏Ferulae resina有助于提高鯉魚免疫和生長相關基因的表達,顯著增強皮膚黏液中溶菌酶活性。WU等[50]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加10.00或20.00 g·kg-1的車前草Plantago asiatica和魚腥草可有效提高軍曹魚Rachycentron canadum非特異性免疫指標,如超氧化物歧化酶活性、活性氧生成、吞噬率、吞噬指數(shù)和溶菌酶活性等。CHEN等[51]發(fā)現(xiàn)黃連素(berberine)可使團頭魴Megalobrama amblycephala的酸性磷酸酶、溶菌酶活性和補體C3,C4含量等免疫指標明顯提高,并使高脂飼料喂養(yǎng)后的氧化應激進程顯著減緩,細胞凋亡率降低。MUSTHAF等[52]發(fā)現(xiàn)南瓜Cucurbita moschata子對莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus的生長性能、先天免疫反應和抗氧化作用的都有較好的促進作用。在4.00和6.00 g·kg-1添加量下喂養(yǎng)4周,魚體補體活性、吞噬細胞活性和溶菌酶活性,顯著提高。YUNIS-AGUINAGA等[53]發(fā)現(xiàn)貓爪草Ranunculus ternatus可以促進尼羅羅非魚的免疫功能,提高生長性能。 BINAII等[54]在飼料中添加 120.00 g·kg-1的大蕁麻Girardinia diversifolia, 投喂歐洲鰉Huso huso8周后,與對照組相比,處理組魚的中性粒細胞和血紅蛋白水平顯著增加,紅細胞與紅細胞比容顯著提高,表明大蕁麻有助于改善歐洲鰉血液生化指標和免疫機能。GUARDIOLA等[55]將葫蘆巴種子與乳酸菌混合飼喂金頭海鯛,2~3周后,皮膚黏液中IgM水平,酶活性(蛋白酶、堿性磷酸酶、酯酶)顯著提高。ADEL等[56]發(fā)現(xiàn)添加30.00 g·kg-1的薄荷Menthae haplocalycis能顯著提高里海白魚Rutilus frisii kutum血液和體液免疫指標。
除了魚類以外,中草藥還能提高其他較低等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的基礎免疫水平。XUE等[57]用10.00,30.00 和 50.00 g·kg-1的復方中草藥制劑以及 10.00 g·kg-1的山楂,10.00 g·kg-1黃芪添加在飼料中投喂皺紋盤鮑Haliotis discus,結果顯示,除了10.00 g·kg-1復方中草藥制劑組外,其他各組血細胞吞噬活性、呼吸氧爆發(fā)活性均顯著提高,50.00 g·kg-1復方中草藥制劑添加組的血清凝集效價顯著增強。薛繼鵬[58]將山楂和黃芪分別加入皺紋盤鮑的飼料中并連續(xù)投喂80 d,發(fā)現(xiàn)兩者均能顯著提高皺紋盤鮑的非特異性免疫指標。王吉橋等[59]用大蒜油等皂苷類天然活性物質制成復方制劑喂飼對蝦,后者血細胞的吞噬率和殺傷率顯著提高。
當前,中草藥研究大多集中在體內(nèi)或體外的抗病毒研究上,抗菌抑菌實驗或免疫力實驗也有報道,但過于側重對使用效果的判斷,而對藥物有效成分和藥效針對的靶器官等方面研究較少。傳統(tǒng)復方中草藥制劑成份復雜,作用機制不清楚,不同中草藥間的協(xié)同、拮抗作用機制的研究報道也較少,如黃連與連翹Forsythia suspensa配伍時,黃連的抗菌性可增強6倍,但其內(nèi)在機制卻并不清楚。因此,今后研究應在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論上加強中草藥的基礎理論研究,逐步弄清漁業(yè)常見中草藥的有效成分及其作用機制;加強單一中草藥及其提取物的研究,深入探討藥理學和毒理學理論,借鑒現(xiàn)代藥學的先進經(jīng)驗逐步改進中草藥有效成分的提取工藝,改進給藥方式,提高中草藥用于病害防治的效率,指導水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的防治。