安神臍貼對(duì)實(shí)驗(yàn)性失眠模型大鼠自主活動(dòng)及血清GABA、NE含量的影響*

甘 雨 馬 進(jìn) 喬 敏 張 宏 包玉龍 武曉琳 劉小虎 焦富英

(遼寧省中醫(yī)藥研究院， 沈陽(yáng) 110034)

隨著生活節(jié)奏的加快，人們所面臨的各種壓力驟增，失眠癥已逐漸成為嚴(yán)重危害公眾健康的問(wèn)題。失眠患者由于睡眠時(shí)間不足、質(zhì)量不佳，致使機(jī)體得不到充分休息，而影響日常生活，表現(xiàn)為精神不振、注意力不集中、行動(dòng)反應(yīng)遲緩、學(xué)習(xí)記憶功能下降，警覺(jué)性水平和判斷力降低[1]。以往臨床多采用鎮(zhèn)靜催眠類(lèi)藥物和心理療法治療，前者短期療效尚可，但需長(zhǎng)期服藥，而長(zhǎng)期用藥會(huì)出現(xiàn)耐藥性、共濟(jì)失調(diào)、依賴性等副反應(yīng)[2]；后者效果不穩(wěn)定，影響因素頗多。因此，探尋一種更有效、安全的治療方法迫在眉睫。安神臍貼為我院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)驗(yàn)處方，由朱砂、黃連、酸棗仁等中藥組成，療效確切，且為外用制劑，安全無(wú)副作用。本研究考察了其對(duì)實(shí)驗(yàn)性失眠模型大鼠自主活動(dòng)的影響，并初步探討了其神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(遼)2012-0003，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h光照/12 h黑暗環(huán)境。

1.2 藥物與試劑

安神臍貼由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑中心提供；地西泮片由上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：14160101。水合氯醛由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150508；對(duì)氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine, PCPA)由SIGMA公司生產(chǎn)，批號(hào)：SHBD9164 V；生理鹽水，華仁藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Q1611028。大鼠γ-氨基丁酸(GABA)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自沈陽(yáng)天瑞誠(chéng)生物科技有限公司，批號(hào)：201703；去甲腎上腺素(NE)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自沈陽(yáng)天瑞誠(chéng)生物科技有限公司，批號(hào)：201703。

1.3 儀器設(shè)備

EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)，荷蘭NOLUDS公司；SPECTRA MAX 190型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；JKDP-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱，廈門(mén)醫(yī)療電子儀器廠。

1.4 方法

1.4.1分組與模型制備: 取40只健康SD大鼠，置于12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、安神臍貼(2.70 g/kg)組和地西泮(0.90×10-3g/kg)組，每組10只。除空白對(duì)照組外其余各組大鼠均腹腔注射PCPA混懸液(350 mg/kg)，空白對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每日上午9：00注射1次，連續(xù)注射2 d。造模大鼠晝伏夜出規(guī)律消失，白天睡眠時(shí)間明顯少于空白對(duì)照組，表明模型制備成功。

1.4.2給藥: 給予貼劑大鼠于給藥前24 h腹部脫毛(6%硫化鈉)，充分暴露神闕穴。安神臍貼組在腹部神闕穴部位貼敷安神臍貼2.70 g/kg，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組在腹部神闕穴部位貼敷空白貼，均用膠布固定6 h以上，1次/d，連續(xù)5 d。地西泮組灌胃給予地西泮0.90×10-3g/kg，1次/d，連續(xù)5 d。

1.4.3一般狀況觀察： 每日觀察大鼠一般狀況及活動(dòng)情況，并于末次給藥前稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，比較大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況。

1.4.4自主活動(dòng)檢測(cè)： 于末次給藥60 min后，采用EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)記錄大鼠自主活動(dòng)情況，該系統(tǒng)由自主活動(dòng)測(cè)試箱和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分構(gòu)成。自主活動(dòng)測(cè)試箱底為1.0 m×1.0 m 正方形不銹鋼箱，箱底內(nèi)中央0.5 m×0.5 m正方形區(qū)域劃分中央?yún)^(qū)，其余為周邊區(qū)，記錄10 min內(nèi)大鼠移動(dòng)距離、速度、出現(xiàn)在中央?yún)^(qū)的頻率及在中央?yún)^(qū)累計(jì)停留時(shí)間。

1.4.5血清GABA、NE含量檢測(cè)： 自主活動(dòng)試驗(yàn)后，將大鼠用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min離心10 min，取血清。按各試劑盒操作步驟處理后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度(A)，采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清GABA、NE含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

造模結(jié)束后，模型組大鼠晝伏夜出規(guī)律消失，皮毛蓬亂無(wú)澤，易激怒，攻擊性增強(qiáng)，白天也不停走動(dòng)，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后逐漸好轉(zhuǎn)，白天活動(dòng)減少，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，體質(zhì)量明顯高于模型對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況Table 1 The body weight changes of rats in

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型對(duì)照組比較,▲P<0.05

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05

2.2 自主活動(dòng)情況

失眠模型組大鼠在移動(dòng)距離、速度、中央?yún)^(qū)出現(xiàn)頻率和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間上均高于空白對(duì)照組，其中在移動(dòng)距離和速度上與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明失眠模型復(fù)制成功。經(jīng)安神臍貼和地西泮治療后，移動(dòng)距離和速度較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)頻率和在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間也有所下降。見(jiàn)表2和圖1。

2.3 血清中GABA、NE含量測(cè)定

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中GABA含量明顯降低(P<0.01)，NE含量明顯升高(P<0.01)。經(jīng)安神臍貼和地西泮治療后，大鼠血清中GABA含量顯著升高(P<0.01)，NE含量顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表2 安神臍貼對(duì)PCPA致失眠大鼠自主活動(dòng)的影響Table 2 Effect of Anshen umbilical paste on autonomic activity in insomnia rats induced by

注：與空白對(duì)照組比較＊P<0.05；與模型對(duì)照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖1 各組大鼠自主活動(dòng)軌跡圖注：A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：安神臍貼組；D：地西泮組Fig.1 The autonomous activity track map of rats in each groupNote：A: blank control group； B: model control group； C: Anshen umbilical paste group； D: Diazepam group

組 別劑量/(g/kg)GABA/(μmol/L)NE/(ng/L)空白對(duì)照組—5.30±0.22107.87±5.41模型對(duì)照組—4.36±0.37??121.37±3.81??安神臍貼組2.705.27±0.39▲▲105.50±3.37▲▲地西泮組 0.90×10-35.52±0.32▲▲94.59±3.00▲▲

注：與空白對(duì)照組比較**P<0.01；與模型對(duì)照組比較▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group**P<0.01; compared with the model control group▲▲P<0.01

3 討論

失眠屬中醫(yī)“不寐”范疇，其病因病機(jī)可歸納為陰陽(yáng)失交，陽(yáng)不入陰，晝夜陰陽(yáng)運(yùn)轉(zhuǎn)失常，其病位在心，與肝、腎功能密切相關(guān)[3]。治療當(dāng)以調(diào)節(jié)陰陽(yáng)失衡，疏通經(jīng)脈，恢復(fù)“陰平陽(yáng)秘”為主[4]。安神臍貼是一種貼敷于臍部(神闕穴)的外用制劑，由朱砂、黃連、酸棗仁等組成，黃連能清心瀉火，酸棗仁可寧心安神，朱砂功專(zhuān)鎮(zhèn)驚安神，諸藥合用可奏清心瀉火、寧心安神、鎮(zhèn)驚安神之功。貼敷于神闕穴，即可通過(guò)透皮吸收發(fā)揮藥效，又可通過(guò)刺激神闕穴發(fā)揮穴效，雙效疊加用以調(diào)和氣血陰陽(yáng)平衡，疏通經(jīng)脈，從而達(dá)到“陰平陽(yáng)秘”的目的[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明，臍部表皮角質(zhì)層薄，皮下靜脈網(wǎng)豐富，有利于藥物透過(guò)皮膚吸收，又可避免肝臟的代謝分解和消化道的降解破壞，從而更好地發(fā)揮藥效[6-7]。同時(shí)對(duì)神闕穴的刺激可調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)、體液平衡和免疫功能，促進(jìn)人體恢復(fù)正常的生理功能。

本研究中安神臍貼可改善失眠模型大鼠的一般狀況，使其白天活動(dòng)減少，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，體質(zhì)量明顯增加，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在自主活動(dòng)方面，失眠模型組大鼠在移動(dòng)距離、速度、中央?yún)^(qū)出現(xiàn)頻率和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間上均高于空白對(duì)照組，其中在移動(dòng)距離和速度上與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)安神臍貼治療后，移動(dòng)距離和速度較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)頻率和在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間也有所下降。表明安神臍貼能夠改善失眠模型大鼠的一般狀況和焦慮樣行為，有促眠作用。

大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，失眠是一種由眾多神經(jīng)遞質(zhì)參與的神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程[8]。GABA是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能抑制神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)傳導(dǎo)，有助于睡眠[9]。本研究中模型組失眠大鼠血清中GABA含量明顯降低(P<0.01)，促眠作用減弱，大鼠出現(xiàn)失眠，白天也活動(dòng)不停。經(jīng)安神臍貼治療后，大鼠血清中GABA含量顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明安神臍貼能增加GABA的分泌，抑制覺(jué)醒和興奮，促進(jìn)睡眠。NE是一種公認(rèn)的參與覺(jué)醒的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[10]，其釋放量增加會(huì)引起交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致睡眠—覺(jué)醒紊亂，反之NE釋放量減少，產(chǎn)生正常睡眠[11]。本研究中模型組大鼠血清中NE含量明顯升高(P<0.01)，導(dǎo)致大鼠睡眠紊亂，經(jīng)安神臍貼治療后，大鼠血清中NE含量顯著下降(P<0.01)，正常睡眠恢復(fù)。可見(jiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)GABA和NE與睡眠—覺(jué)醒周期關(guān)系緊密，而安神臍貼改善睡眠作用的機(jī)制可能與增加GABA分泌，減少NE釋放，從而抑制神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)傳導(dǎo)，減弱交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，維持睡眠—覺(jué)醒周期恒定有關(guān)。