添加植物乳桿菌對桑枝葉與玉米秸稈混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

■唐慶鳳 楊承劍 彭開屏 郭艷霞 李麗莉 梁 辛李孟偉 唐振華

（中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

隨著畜牧業(yè)迅速增長，常規(guī)飼料資源不斷緊缺，尋找新的飼料資源已迫在眉睫。廣西是我國主要的蠶?；?，據(jù)統(tǒng)計，2016年廣西桑園面積達20.53萬公頃[1]，桑枝葉具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸含量豐富、消化率高、產(chǎn)能高等特點，作為畜禽飼料具有較大的開發(fā)潛力和重要的利用價值[2-3]。但桑樹冬季無法提供桑葉，而反芻動物主要是在冬季缺乏青綠飼料的供給，如能將鮮桑枝葉進行青貯處理，不僅可以大大延長桑枝葉飼料利用時間，使其適口性增強，可消化營養(yǎng)含量提高，還可以填補草食畜牧業(yè)飼草冬季生長淡季草料來源受限的缺陷，促進草食畜牧業(yè)的發(fā)展。

優(yōu)質(zhì)青貯飼料調(diào)制不僅需要嚴格的厭氧條件，原料中還應有充足的乳酸菌數(shù)量和活性及足夠的水溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC），研究表明，乳酸菌數(shù)量達到青貯原料鮮重的105CFU/g以上，新鮮原料中WSC含量為25～35 g/kg，是成功青貯的最低限度[4]。董志浩等[5]研究顯示：桑葉原料表面附著的乳酸菌數(shù)量為106.73CFU/g FW，與玉米和紫花苜蓿附著的乳酸菌數(shù)量相當，但桑葉直接青貯前7 d未見大量乳酸生成，而添加乳酸菌青貯組第7 d乳酸含量已達到桑葉直接青貯組的6倍以上，pH值降至4.27以下，表明添加乳酸菌明顯改善了桑葉青貯發(fā)酵品質(zhì)，可能是因為桑葉本身附著的乳酸菌數(shù)量雖然較多，但是活性不強，且產(chǎn)乳酸能力較弱。Hristov等[6]在全株玉米青貯中添加不同類型的乳酸菌制劑明顯降低了pH值、丁酸和氨態(tài)氮的含量，提高了總酸和乳酸的含量。趙慶杰等[7]研究表明，在青稞秸稈和多年生黑麥草混合青貯中添加乳酸菌，加速了青貯早期乳酸的發(fā)酵進程。吳配全等[8]在肉牛日糧中分別添加青貯桑葉10%和20%，可使肉牛增重的飼養(yǎng)成本下降0.29～0.49元/kg，而且添加20%桑葉有增加肉牛血液中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的趨勢。朱萬福等[9]開展了桑枝葉混合青貯育肥灘羊公羔效果研究，結果表明：試驗組比對照組日增重提高4.06%（P＞0.05），料肉比降低1.03%（P＞0.05），研究還表明，調(diào)制桑枝葉青貯和全株玉米青貯混合比單一性桑枝葉青貯或者全株玉米青貯飼養(yǎng)效果較好。目前國內(nèi)外的研究大多集中在乳酸菌對桑葉發(fā)酵效果的影響，桑葉及桑枝葉青貯飼料飼喂效果等方面，但添加乳酸菌對桑枝葉及玉米秸稈混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響未見報道。因桑葉本身附著的乳酸菌活性不強，產(chǎn)乳酸能力較弱，且桑枝葉的WSC含量偏低，因此桑枝葉直接青貯較難獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料。本試驗在桑枝葉與玉米秸稈混合（鮮質(zhì)量比為1∶1）青貯的基礎上，通過添加植物乳桿菌制劑以期進一步改善混合青貯發(fā)酵品質(zhì)，為桑枝葉飼料的開發(fā)及利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料：新鮮玉米秸稈（蠟熟期）由廣西水牛研究所水牛種畜場提供，新鮮桑枝葉由桂平市桑樹種植基地提供。混貯原料的營養(yǎng)水平見表1。

表1 原料的營養(yǎng)水平（風干基礎）

添加劑：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LAP），購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：MRS的液體培養(yǎng)基用于LAP活化和菌液培養(yǎng)，MRS固體培養(yǎng)基用于LAP涂板計數(shù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化及擴培

LAP安瓿管凍干菌種→活化→按5%添加量接種到MRS的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，靜態(tài)厭氧培養(yǎng)。接種液計數(shù)：采用涂板對LAP接種液進行計數(shù)。

1.2.2 試驗設計

將桑枝葉與玉米秸稈以1∶1的鮮重比例進行混合，本試驗在青貯原料中分別加入不同水平的乳酸菌添加劑，設置5個處理，每個處理3個重復，各處理LAP菌液添加量分別為青貯原料鮮重的0%、2%、4%、6%和8%。

1.2.3 青貯調(diào)制

試驗在廣西水牛研究所研發(fā)中心進行，將桑枝葉與玉米秸稈進行人工切斷，長度為2 cm左右，按1∶1比例進行稱樣，裝入聚乙烯薄膜袋中，每袋混合青貯原料400 g，各處理乳酸菌添加量按照設計比例進行，混合均勻，用真空泵抽出袋內(nèi)的空氣至真空狀態(tài)，密封，避光置于室溫下貯藏60 d，開袋進行發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分分析。各組植物乳桿菌（LAP）菌落單位見表2。

表2 各組植物乳桿菌菌落單位(CFU/g)

1.3 測定項目及方法

1.3.1 常規(guī)項目

采用常規(guī)的測定方法[10]測定樣品中的DM、CF、CP含量。

1.3.2 青貯飼料感官評定

感官評定參考我國農(nóng)業(yè)部1996年發(fā)布的《青貯飼料質(zhì)量評定標準（試行）》進行，通過色澤、氣味、質(zhì)地及霉變等情況進行評定，感觀評定標準見表3，再以乙酸和丁酸的含量來評價發(fā)酵飼料的等級[11]。

表3 發(fā)酵感官評定標準

1.3.3 青貯飼料品質(zhì)項目分析

1.3.3.1 樣品預處理

開袋后，每袋準確稱35 g樣品，放入250 ml的廣口瓶中，再加入150 ml超純水，使樣品完全浸入在水中，用封口膠將廣口瓶蓋密封，放入4℃冰箱提取24 h，取出后使用2層紗布進行過濾，濾液用于揮發(fā)性脂肪酸、乳酸、pH值的測定。剩余的青貯飼料樣品在65℃下烘干、粉碎（過40目篩）制成風干樣，用于常規(guī)營養(yǎng)成分及WSC的測定。

1.3.3.2 揮發(fā)性脂肪酸的測定

取1.3.3.1節(jié)所獲得的濾液0.5 ml，加入8.2%偏磷酸0.5 ml，于13 000 r/min離心10 min，然后取上清液加入巴豆酸后，用Agilent-7890A型氣相色譜儀[12]進行測定，測定樣品中乙酸、丙酸、丁酸的含量。

1.3.3.3 乳酸測定

青貯飼料中乳酸含量用試劑盒進行測定，試劑盒的貨號為A019-2，廠家為南京建成生物工程研究所。

1.3.3.4 pH值測定

pH值采用便捷式pH計進行測定，pH計型號：HANNA HI-8424。

1.3.3.5 干物質(zhì)回收率（dry matter recovery，DMR）的測定

DMR（%）=(開封時樣品質(zhì)量×樣品干物質(zhì)率)/（裝袋時裝入樣品的質(zhì)量×樣品原料干物質(zhì)率）×100[12]。

1.3.3.6 可溶性碳水化合物測定

采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性碳水化合物含量[13]?？扇苄蕴窃跐饬蛩崛芤褐邢让撍疄樘侨┗蛄u基糖醛，再與蒽酮發(fā)生反應生成藍綠色化合物，其顏色與含糖量成正比，吸收峰波長為640 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先使用EXCEL軟件進行處理，再使用SPSS 17.0軟件進行單因子方差分析和Duncan's多重比較檢驗，試驗結果的差異顯著性以P＜0.05作為判斷標準，試驗數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準差”的方法來表示。

2 結果

2.1 營養(yǎng)成分分析（見表4）

由表4可知，各試驗組的DM含量均低于對照組，其中，LAP 8%組DM含量最低，與對照組相比降低了7.14%（P＜0.05）。DMR含量各組間差異不顯著（P＞0.05），但各試驗組的DMR含量均高于對照組。CP和CF含量各組間差異不顯著（P＞0.05），其中，LAP 6%組的CP含量最高，CF含量最低。各試驗組的WSC含量均高于對照組，LAP 4%組WSC含量最高，與對照組相比升高了51.82%（P＜0.05）。

表4 植物乳桿菌對混貯料營養(yǎng)成分的影響

2.2 發(fā)酵品質(zhì)分析（見表5）

由表5可知，隨著植物乳桿菌制劑添加量的增加pH值不斷下降，LAP 6%組和LAP 8%組的pH值均顯著低于對照組（P＜0.05），與對照組相比，分別降低了1.66%（P＜0.05）和4.98%（P＜0.05）。各試驗組乳酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中，LAP 6%組的乳酸含量最高，與對照組相比，升高了56.48%（P＜0.05）。乙酸含量各組間差異不顯著（P＞0.05），其中LAP 6%組含量最高為55.13 mmol/kg。丙酸含量LAP 8%組最高，且顯著高于其他各組（P＜0.05）。丁酸含量各組間差異不顯著（P＞0.05），各試驗組丁酸含量均低于對照組，且LAP 6%組丁酸含量最低。

表5 植物乳桿菌對混貯料發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 發(fā)酵品質(zhì)的評定（見表6、表7）

由表6可知，發(fā)酵60 d后，LAP 2%組感官質(zhì)量稍差，開袋時芳香味較弱，有淡酸味，質(zhì)量評分為42分，青貯效果評定為良好。其他各組開袋時均有甘酸香味，呈亮黃色，結構良好，青貯質(zhì)量評定為優(yōu)等,且LAP 6%組評分最高為48分。以乙酸和丁酸含量評定發(fā)酵品質(zhì)的結果見表7，由表7可知，各組發(fā)酵品質(zhì)均達到1級水平。

表6 混貯料發(fā)酵品質(zhì)的感官評定

表7 以乙酸和丁酸含量評價混貯料發(fā)酵品質(zhì)

3 討論

3.1 添加植物乳桿菌對桑枝葉與玉米秸稈混貯料營養(yǎng)成分的影響

乳酸菌制劑是目前應用于青貯飼料生產(chǎn)中最為常用的青貯添加劑，它的主要作用是調(diào)節(jié)青貯飼料內(nèi)微生物區(qū)系，調(diào)控青貯發(fā)酵過程，更有效地保存飼料的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。張淑枝等[15]研究乳酸菌制劑對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)及消化率的影響，結果表明，在全株玉米中添加10 g/t（青貯鮮重）的乳酸菌制劑，青貯80 d，與對照組相比，乳酸菌制劑處理組顯著地提高了青貯料的干物質(zhì)回收率（P＜0.05），提高幅度為15.39%。榮輝等[16]為評價添加乳酸菌制劑、綠汁發(fā)酵液和葡萄糖對象草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，結果顯示與對照組相比，無論是葡萄糖單獨添加組還是與乳酸菌制劑組合添加組均提高了整個青貯過程中的WSC含量。本試驗在桑枝葉與玉米秸稈混貯中添加不同劑量的植物乳桿菌制劑，一定程度上減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失，經(jīng)過60 d的青貯，結果也顯示各試驗組的DMR和WSC含量均高于對照組，且LAP 4%組的WSC含量顯著高于對照組（P＜0.05），可能是由于添加了植物乳桿菌制劑使乳酸菌在發(fā)酵前期迅速占領了主導地位，LAP以青貯原料中的糖為底物通過糖酵解途徑降解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸，使青貯飼料pH值降低，從而抑制其他有害微生物的活性，抑制了青貯過程中微生物和植物蛋白酶對氨基酸和蛋白質(zhì)的降解作用，從而減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失[17]，而試驗中LAP 6%組的WSC含量在各試驗組中最低，可能是由于添加的LAP數(shù)量及青貯原料含水量較合適，使LAP能夠充分發(fā)揮活性，將青貯原料中較多的糖轉化為乳酸。添加植物乳桿菌制劑后，各試驗組的CF含量均低于對照組，但差異不顯著，與Meeske等[18]的研究結果一致，可能是由于青貯料在發(fā)酵過程中纖維被軟化，且在酶類和微生物的作用下部分纖維被降解[19]。各組CP含量差異不顯著，但含量均達到15.5%左右，可滿足青年牛及干奶牛對日糧蛋白質(zhì)的要求。廣西山多地少，缺乏優(yōu)質(zhì)牧草，而桑枝葉產(chǎn)量大，營養(yǎng)全面豐富，桑枝葉與玉米秸稈混貯，可使桑枝葉飼料適口性增強，可消化營養(yǎng)含量提高，發(fā)酵后產(chǎn)生大量的益生菌，還能夠調(diào)節(jié)家畜的胃腸道的菌群環(huán)境，提高家畜的免疫機能和抗病能力，有利于促進桑枝葉高效處理及飼料化，為反芻動物提供更加豐富的飼料資源，促進草食畜牧業(yè)的發(fā)展，同時還可以在一定程度上提高桑農(nóng)的經(jīng)濟效益。

3.2 添加植物乳桿菌對桑枝葉與玉米秸稈混貯料pH值及有機酸含量的影響

青貯原料附著的乳酸菌種類和數(shù)量是影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要因素之一，因此青貯時添加乳酸菌，尤其是同型發(fā)酵乳酸菌如植物乳桿菌等，可以促進青貯早期乳酸的產(chǎn)生，迅速降低青貯飼料的pH值，從而抑制霉菌和丁酸梭菌等有害微生物的活性，降低氨態(tài)氮及丁酸含量，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[20]。本試驗中，隨著植物乳桿菌制劑添加量的增加，pH值不斷下降，對照組pH值為4.22未達到優(yōu)質(zhì)青貯的要求，但LAP 6%組和LAP 8%組的pH值分別為4.15和4.01均達到了優(yōu)質(zhì)青貯的要求，且各試驗組乳酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），這可能是由于原料本身附著的乳酸菌活性不強，產(chǎn)乳酸能力較弱，添加植物乳桿菌制劑增加了桑枝葉與玉米秸稈混貯料青貯初期同型乳酸菌的數(shù)量，提高了乳酸的產(chǎn)生速率，導致乳酸含量升高，pH值降低，有利于抑制有害微生物的活性，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，這與劉輝等[21]和董志浩等[5]的研究結果一致。

有機酸含量是評價青貯發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標，其中最重要的是乳酸、丁酸和乙酸含量，優(yōu)質(zhì)青貯飼料應具有較高含量的乳酸和較低含量的丁酸[22]。一般認為優(yōu)質(zhì)的青貯飼料丁酸含量應該低于1%DM[23]。丁酸是有害微生物分解蛋白質(zhì)、糖類和乳酸的產(chǎn)物，易導致青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)的損失，且蛋白質(zhì)分解會產(chǎn)生使青貯飼料具有惡臭的氨或胺，影響青貯品質(zhì)。本試驗中各組丁酸含量均低于優(yōu)質(zhì)青貯的丁酸含量推薦值（小于1%DM），但各試驗組丁酸含量均低于對照組，且LAP 6%組丁酸含量最低，說明在桑枝葉與玉米秸稈混貯料中添加植物乳桿菌制劑，能在一定程度上抑制丁酸梭菌的活性，降低丁酸的含量，且LAP 6%組添加效果最好。王應芬等[24]研究酶和乳酸菌對多年生黑麥草與玉米秸稈混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，結果也表明添加乳酸菌制劑或酶制劑均提高了玉米秸稈與多年生黑麥草混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，添加劑組丁酸含量、pH值均顯著低于對照組（P＜0.05），而乳酸和水溶性碳水化合物含量增加。乙酸具有較強的抗真菌能力，能夠有效地抑制青貯料有氧暴露階段霉菌、酵母菌的生長繁殖[25]。本試驗中乙酸含量各組間差異不顯著（P＞0.05），可能是因為試驗中添加的乳酸菌制劑為植物乳桿菌，植物乳桿菌屬于同型乳酸菌，同型乳酸菌將一分子六碳糖轉化為兩分子乳酸，沒有乙酸產(chǎn)生。

3.3 青貯發(fā)酵品質(zhì)評價

王昆昆等[26]研究不同乳酸菌制劑添加量對不同比例披堿草和苜?；熨A發(fā)酵品質(zhì)的影響，發(fā)酵45 d后采用V-score評定體系進行發(fā)酵品質(zhì)評定，結果顯示在40∶60、50∶50和30∶70混貯比例中，未添加乳酸菌制劑的對照組得分最低，等級評定為尚可，其中以30∶70混貯料乳酸菌制劑添加量為0.025%時青貯料得分最高。還表明乳酸菌制劑對披堿草和苜?；熨A的發(fā)酵品質(zhì)有顯著影響(P＜0.05)。感官評定主要通過觀察青貯料氣味、色澤和質(zhì)地等來粗略評判發(fā)酵品質(zhì)[27]，而Kaiser評價體系主要評價不良發(fā)酵，丁酸的產(chǎn)生會伴隨較高的pH值及蛋白質(zhì)的大量降解，乙酸含量反映青貯料的保存性能和有氧穩(wěn)定性，該評定體系適合所有牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的評定[11]。本試驗先參照我國農(nóng)業(yè)部1996年發(fā)布的《青貯飼料質(zhì)量評定標準（試行）》來對青貯品質(zhì)進行感官評定，然后再以乙酸和丁酸的含量來評價發(fā)酵飼料等級，綜合兩個評價體系的結果為：桑枝葉與玉米秸稈以1∶1鮮質(zhì)量比混貯，雖然不添加任何添加劑也可青貯成功，但添加植物乳桿菌制劑后青貯效果更好，有利于提高該混貯發(fā)酵品質(zhì)，其中LAP 6%組發(fā)酵品質(zhì)最佳。

4 結論

在本試驗條件下，桑枝葉與玉米秸稈以1∶1鮮質(zhì)量比混貯，雖然不添加任何添加劑也可青貯成功，但添加植物乳桿菌制劑后青貯效果更好，有利于降低混貯料的pH值，減少營養(yǎng)成分損失，提高發(fā)酵品質(zhì)，當植物乳桿菌制劑添加量為6%（占青貯原料鮮重）時，發(fā)酵品質(zhì)最佳。