屎腸球菌制劑對泌乳中期奶牛血清生化、抗氧化和免疫指標的影響

■徐巧云 王夢芝* 霍永久 羅昱宏

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009；2.濱海普潤生物科技有限公司，江蘇鹽城224500）

隨著國民經(jīng)濟和人們生活水平的不斷提高，人們對牛奶的需求數(shù)量以及牛奶的品質要求也不斷提升。影響牛奶質量的因素很多，而預防奶牛疾病，提高免疫力，降低病原微生物的侵襲是培育健康奶牛的重點工作[1]。近年來，微生態(tài)制劑已成為公認的理想抗生素替代品，其能有效地增加有益菌的數(shù)量，抑制病原微生物菌群的定植，從而改善腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力[2]。尤升波等[3]添加乳酸菌、酵母菌等復合微生態(tài)制劑，在一定程度上增強奶?？篃釕つ芰Γ纳破涿谌樾阅?，減緩奶牛夏季高溫條件下奶產量下滑的情況。屎腸球菌作為腸道常見的益生菌不僅可以通過生物拮抗、生物奪氧、增加有益菌數(shù)量，增強機體免疫機能，并且具有提高飼料轉化率,改善生產性能,提高動物產品品質等作用[4]。研究表明，6周齡雌性小鼠口服屎腸球菌可以顯著增加小鼠血漿中IgG濃度，白細胞介素4（IL-4），白細胞介素-6（IL-6）和干擾素-γ（IFN-γ）水平[5]。Pollmann等[6]研究屎腸球菌對豬自然衣原體感染率時發(fā)現(xiàn)，給飼喂添加有屎腸球菌的日糧后，斷奶仔豬腸道內定植的致病菌有所下降,并且仔豬腹瀉情況也有所緩解。朱芬花等[7]研究表明，在平均日采食量、平均日產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、IgG含量、IgA含量、IgM含量中，III組（精飼料與粗飼料比60∶40）顯著高于I組（精飼料與粗飼料比40∶60）。

屎腸球菌在培養(yǎng)過程中能產生大量的乳酸,屬乳酸菌[8]。在復合乳酸菌對奶牛泌乳性能、血液免疫和抗氧化指標的影響的研究中，劉華偉等[9]發(fā)現(xiàn)飼喂30 g/d乳酸菌制劑與對照組相比，顯著提高了奶牛的產奶量，并且奶牛血清中免疫球蛋白G(IgG)和可溶性CD4(SCD4)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)的活性均顯著升高。綜上所述，提高產奶量，改善乳品質與動物本身的健康存在一定的聯(lián)系。為此，本試驗以屎腸球菌為研究對象，在奶牛飼糧中添加不同量的屎腸球菌的方式來觀察其血清生化、抗氧化、免疫指標的變化，以期為探討益生菌與促進牛奶品質的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗隨機分為3組：對照組（基礎日糧）、低劑量組[基礎日糧+30 g/(d·頭)屎腸球菌]、高劑量組[基礎日糧+60 g/(d·頭)屎腸球菌]，每組8個重復。選擇24頭體重、胎次（1～2胎）、泌乳期（40±2）d、泌乳量（21.0±1.0）kg、體況（3.0分）等性狀相對一致的荷斯坦奶牛作為試驗動物。試驗期為42 d，包括預試期14 d，正試期28 d。根據(jù)揚州大學實驗農牧場提供并參照NRC（2001）[10]奶牛飼養(yǎng)標準配制試驗基礎日糧，日糧采用TMR混合機混合（基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1）。保證試驗奶牛均固定槽位，適當運動，自由飲水，飼養(yǎng)管理皆保持一致。本試驗屎腸球菌由濱海普潤生物科技有限公司提供，為粉狀，白色，使用石灰粉攪拌稀釋，細菌數(shù)含量為1.0×1010CFU/g。同舍分單圈飼養(yǎng)試驗牛，每天早晚適量飼喂2次（添加劑先與部分日糧先混合，再混合），分早、中、晚3次擠奶。

1.2 樣品采集

分別在正試期第0、14、28 d晨飼前采集尾靜脈血樣，部分加入EDTA·Na2抗凝管中，用于血常規(guī)分析，部分加入促凝管中，3 000 r/min離心5 min獲取血清，用于免疫球蛋白等生化指標測定。

1.3 血清免疫球蛋白IgA、IgG及IgE測定

購買北京華英生物技術研究所的牛IgA、IgG、IgE檢測試劑盒，進行測定血清中IgA、IgG及IgE，具體測定步驟參照試劑盒說明書進行。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）

1.4 血清免疫細胞因子IL-1、IL-6及TNF-α測定

均采用放射免疫法測定，所使用的IL-1、IL-6、ALCAM及TNF-α檢測ELISA試劑盒均購自上海R&B公司，具體測定步驟參照試劑盒說明書進行。

1.5 血常規(guī)及血液生化指標測定

血清樣品送至揚州市疾病控制中心測定總蛋白、白球比、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇濃度及谷草轉氨酶等指標。

1.6 血清抗氧化等指標測定

還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛的測定分別采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.7 統(tǒng)計分析

所獲得的數(shù)據(jù)資料采用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析和鄧肯氏多重比較。P值小于0.05為顯著差異水平。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌對荷斯坦奶牛血常規(guī)和血液生化指標的影響（見表2、表3）

由表2可知，添加屎腸球菌在白細胞、血紅蛋白、血小板、紅細胞壓積、紅細胞平均體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度、紅細胞分布標準差上無明顯差異（P＞0.05）；紅細胞低劑量組顯著高于高劑量組（P＜0.05），與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；時間上，除紅細胞分布寬度在第28 d顯著低于第0、14 d（P＜0.05），其他指標均無顯著差異（P＞0.05）。

由表3可知，白蛋白、堿性磷酸酶、總膽固醇、總蛋白、血中尿素氮、甘油三酯在處理組和時間軸上無顯著差異（P＞0.05）；高劑量組乳酸脫氫酶顯著低于對照組（P＜0.05），與低劑量組相比差異不明顯（P＞0.05），時間軸上，白蛋白含量差異不顯著（P＞0.05）；低劑量組在谷丙轉氨酶和血糖中與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），但顯著高于高劑量組（P＜0.05），谷丙轉氨酶在時間軸上無顯著差異（P＞0.05），但血糖在時間上差異顯著（P＜0.05），并隨著時間變化逐步增高；谷草轉氨酶在低劑量組顯著高于對照組（P＜0.05），與高劑量組相比差異不顯著（P＞0.05）；高密度脂蛋白含量在第28 d顯著低于第0、14 d，但處理組間差異不明顯（P＞0.05）；對照組低密度脂蛋白與高劑量組無顯著差異（P＞0.05），但高于低劑量組（P＜0.05），時間上，第28 d與第14 d差異不顯著（P＞0.05），顯著高于第0 d（P＜0.05）。

2.2 對奶牛血清抗氧化和免疫指標的影響(見表4)

由表4可知，丙二醛、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶組間無顯著差異（P＞0.05），丙二醛濃度和還原型谷胱甘肽濃度在第28 d均顯著高于第14 d（P＜0.05），第14 d的超氧化物歧化酶活力與其他兩個時間點差異不顯著（P＞0.05），但第0 d顯著低于第28 d（P＜0.05），過氧化氫酶的活力在第0 d顯著高于第14、28 d（P＜0.05）；IgG、IgA組間差異不明顯（P＞0.05），IgA時間上第14 d含量最高，第0 d其次，第28 d最低，第28 d的IgG含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）；高劑量組腫瘤壞死因子顯著低于對照組和低劑量組，腫瘤壞死因子在第28 d的含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）；白細胞介素1、白細胞介素6在處理和時間上無顯著差異（P＞0.05）；細胞黏附因子處理組間無明顯差異（P＞0.05），但第28 d的含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）。

表2 屎腸球菌對血常規(guī)的影響

3 討論

3.1 屎腸球菌對荷斯坦奶牛血常規(guī)和血液生化指標的影響

屎腸球菌是新培育出的乳酸菌類微生態(tài)制劑，屬于益生菌的一種，其能通過分泌有機酸和細菌素等物質抑制有害菌的生長，與致病菌競爭，調整腸道菌群平衡，提高動物健康水平[11]。血液作為動物機體內環(huán)境重要的組成部分之一，動物機體的健康和代謝狀況可根據(jù)其生理生化指標的改變進行評估[12]。正常生理狀況下，血液中紅細胞的數(shù)量是處于穩(wěn)定狀態(tài)，其數(shù)量也可以根據(jù)紅細胞壓積來反應。紅細胞具有吞噬、免疫、防御感染等作用，并且紅細胞的數(shù)量決定了血紅蛋白的數(shù)量，而血紅蛋白使紅細胞具有運輸氧的功能[13]。研究證明，血液中紅細胞表面所具有的紅細胞C3b受體花環(huán)(C3bRR)能使組織免遭循環(huán)免疫復合物沉積所致的損傷，黏附、清除免疫復合物,并且紅細胞也參與機體免疫功能[14]。饒家榮[15]通過對昆明荷斯坦奶牛紅細胞(RBC)C3bRR和免疫復合物花環(huán)(ICR)的檢測發(fā)現(xiàn)健康奶牛紅細胞膜上也具有C3b受體。另外，紅細胞膜上的多種免疫物質及其細胞因子能夠促進淋巴細胞的增殖和分化，并參與T淋巴細胞、NK細胞、吞噬細胞等的免疫功能調節(jié)[16]。文靜等[17]在屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響的研究中發(fā)現(xiàn)飼喂添加屎腸球菌(菌含量為1×106CFU/g飼料)，提高了仔豬血清中C3、C4補體水平，分別為25.00%和76.08%。

表3 屎腸球菌對血清生化指標的影響

王永等[11]研究表明，飼糧中添加300 mg/kg的屎腸球菌相對于抗生素組顯著提高了血液中的紅細胞總數(shù)和血紅蛋白含量。本試驗中，低劑量組的紅細胞數(shù)量顯著高于高劑量組，且血紅蛋白和紅細胞壓積中低劑量組數(shù)值上高于其他兩組，說明屎腸球菌可能通過促進血紅蛋白含量從而促進奶牛的免疫力。

表4 屎腸球菌對血液抗氧化和免疫指標的影響

血糖的相對恒定對維持機體的正常生理功能有重要意義，其主要來源于小腸內糖類的消化吸收和肝糖原的分解[18]。血糖濃度值過高或過低均不利于動物的正常生理代謝[19]。血糖濃度的升高刺激機體釋放胰島素，從而促進糖原、蛋白質合成及脂肪的沉積，有利于機體的合成代謝；低血糖濃度的降低促進胰高血糖的產生從而促進糖異生和糖原分解[20]。林謙等[21]在益生菌與酶制劑對黃羽肉雞血液生化指標和免疫性能影響的協(xié)同效應研究中發(fā)現(xiàn)各組血清葡萄糖含量差異不顯著，但是益生菌與酶制劑組合添加組的血糖濃度相對較高，這說明了益生菌與酶制劑兩者組合促進腸道吸收入血液的葡萄糖量，有提高機體能量代謝水平的趨勢。有研究表明，飼糧中添加屎腸球菌混合添加劑或者單獨添加屎腸球菌，都能提高圍產奶牛泌乳量和血液中葡萄糖和胰島素的水平，降低游離脂肪酸水平[22]。本試驗低劑量組血糖濃度與參考值(3.2±0.38)mmol/l接近，對照組和高劑量組相對較低，這說明屎腸球菌低劑量組有促進血糖穩(wěn)定的作用[23]。

機體內大部分轉運的脂肪酸被肝臟吸收后可通過酯化與磷脂、載體脂蛋白等結合形成脂蛋白，這里主要是極低密度脂蛋白。極低密度脂蛋白在轉運過程中，失去甘油三酯，從而形成低密度脂蛋白，而低密度脂蛋白會進一步形成高密度脂蛋白[24]。飼糧中添加益生菌有助于奶牛瘤胃菌群活力的激活，有益菌數(shù)量的增加及飼料中纖維分解速度的加快，從而促進揮發(fā)性脂肪酸的合成,最終有利于提高泌乳量[25]。本試驗中，低密度脂蛋白在低劑量組顯著低于其他兩組，而第0 d三組低密度脂蛋白含量差異本身較大，這可能是屎腸球菌促進乳腺吸收血液中C16∶0等與極低密度蛋白結合的脂肪酸或者極高密度蛋白與多不飽和脂肪酸結合的形式[26]。乳酸脫氫酶主要存在于肝臟、心肌、腎臟等重要部位，是動物體反應能量代謝重要指標之一，其主要功能是在糖代謝過程中催化丙酮酸產生乳酸[27]。有研究證明，當動物體有少量組織壞死時，組織中的乳酸脫氫酶會釋放進入血液中，從而使其濃度增加[28]。另外，乳酸脫氫酶含量的高低也反映了奶牛的應激狀態(tài)[18]。谷丙轉氨酶主要存在于肝臟中，谷草轉氨酶含量最多的組織是心臟和骨骼肌，其次是肝臟、肝臟細胞或某些損傷或壞死組織中[27]。谷丙轉氨酶正常值在14～38 U/l，谷草轉氨酶在78～132 U/l[29]。江科等[30]研究表明，每天飼喂乳酸菌，奶牛乳脂率、乳

蛋白率和乳糖含量與對照組相比差異不顯著，但泌乳量增加了1.59 kg/(頭·d)。本試驗中，低劑量組乳酸脫氫酶含量在其他兩組之間，說明低劑量組奶牛處于相對安靜、平穩(wěn)狀態(tài)。低劑量組的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶濃度均在正常值范圍以內，但低劑量組數(shù)值上均高于其他兩組，這可能是由于奶牛泌乳量的提高，對肝臟發(fā)生了一定程度的損害，從而使谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶濃度有所升高；谷草轉氨酶在對照組中濃度低于參考值，但隨著時間漸漸升高，可能是接近分娩造成的差異[20]。

3.2 屎腸球菌對奶牛血清抗氧化和免疫指標的影響

氧化應激指機體遭受各種有害刺激時，體內產生過多的高活性分子，例如活性氮自由基和活性氧自由基，過多氧自由基的積累會破壞抗氧化和氧化之間的平衡，導致機體生物大分子受損從而影響細胞的生物學功能，最終導致細胞凋亡[31]。研究證明，添加微生物制劑能有效地提高血清中超氧化物歧化酶的含量，而超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽、丙二醛等抗氧化酶可以有效地預防氧自由基的堆積[32]。丙二醛是油脂氧化酸敗重要的有毒有害物質之一，其可能通過細胞膜脂質過氧化，促使細胞膜結構完整性受到損傷作用，導致細胞凋亡[33]。王永等[11]在飼糧中添加500 mg/kg的屎腸球菌研究表明，添加屎腸球菌可以降低血清中丙二醛水平，增強機體抗氧化能力。本試驗中丙二醛含量隨時間顯著增加，這可能是本試驗處于夏季，動物應激較大，但低劑量組丙二醛含量在數(shù)值上低于其他兩組。據(jù)文靜等[17]報道，屎腸球菌能提高仔豬免疫力，與對照組相比，仔豬血清中IgA、IgG和谷胱甘肽分別提高了16.48%、25.43%、46.80%，但總超氧化物歧化酶活力降低了10.38%。夏鍇等[8]在屎腸球菌飼用效果及作用機理中表明，添加屎腸球菌可以顯著提高仔豬胰臟中過氧化氫酶活性，降低丙二醛含量。肖麗霞等[34]給急性酒精性肝損傷小鼠飼喂屎腸球菌發(fā)現(xiàn)，小鼠體內超氧化物歧化酶和還原型谷胱甘肽含量顯著升高，但丙二醛含量顯著降低。

屎腸球菌在腸道內迅速定植，消耗掉腸內的氧氣和過氧化氫，降低了腸道內氧化還原電位，形成良好的厭氧環(huán)境，且有研究證明，日糧中添加屎腸球菌可以顯著提高過氧化氫酶的活性[8]。M.Fukata等[35]研究表明，給小鼠飼喂選擇性乳酸桿菌可以抑制炎性細胞因子IL-1β、γ干擾素、腫瘤壞死因子-α信使RNA的表達。另外也有報道認為嗜酸性乳酸桿菌等可刺激人類或小鼠樹突狀細胞，樹突狀細胞開始成熟，細胞表面開始呈現(xiàn)能夠捕獲抗原的主要組織相容性復合體(MHC)，然后在MHC刺激下機體開始合成腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-β(IL-β)和白細胞介素-12(IL-12)等炎癥相關細胞因子[36]。Konstantinov等[37]報道，鼠李糖乳酸桿菌GG可減少腫瘤壞死因子對結腸上皮的損傷,促進結腸上皮細胞生長。乳酸菌可以根據(jù)菌量的變化來調節(jié)IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的含量[36]。本試驗在丙二醛、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶組中IgG、IgA、細胞黏附因子等無顯著影響，其中過氧化氫酶、IgG、IgA、腫瘤壞死因子、細胞激活黏附因子在時間軸上顯著降低，這可能是處于夏季，動物應激較大，免疫力下降，機體內自由基過多，抗氧化反應激烈。但高劑量屎腸球菌組在腫瘤壞死因子中顯著低于對照組和低劑量屎腸球菌組，這表明在日糧中添加屎腸球菌在一定程度上能夠提高機體抗氧化和增強機體對疾病的抵抗能力。

4 結論

綜上表明，飼糧中低劑量的添加屎腸球菌，提高了紅細胞數(shù)量和抗腫瘤因子的濃度，降低了乳酸脫氫酶的濃度，有利于機體免疫力的提高。