QX-314抑制細菌穿孔毒素和神經(jīng)元TRPV1介導的金黃色葡萄球菌引發(fā)的疼痛

編者按：繼2013年美國哈佛醫(yī)學院Isaac Chiu 等發(fā)表了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)不依賴免疫系統(tǒng)的作用，而是直接激活痛覺感受器并引起疼痛(Nature 2013)的研究以來，近期Chiu 實驗室繼續(xù)報道了活細菌感染期引發(fā)的疼痛的機制。他們運用活的MRSA菌株、毒力調(diào)控位點以及受其調(diào)控的穿孔毒素位點突變的MRSA菌株感染小鼠，采用行為學、鈣成像技術(shù)、離體多通道電生理技術(shù)探討了活細菌感染期引起的自發(fā)痛和熱痛敏的分子機制；并證明了QX-314，一種不通透細胞膜的鈉離子通道阻滯劑可以在細菌感染時由穿孔毒素引起的孔道帶入傷害性感受器起到鎮(zhèn)痛作用。這一研究成果除了揭示了細菌感染期導致的自發(fā)痛和熱痛敏的分子機制以外還證明了QX-314可以作為治療細菌感染引起的疼痛的有效藥物。

1.研究背景

疼痛是一種不愉快的感受，它是機體針對外界的有害刺激做出的保護性的反應(yīng)。慢性痛則是神經(jīng)系統(tǒng)對炎癥和損傷作出的不適應(yīng)性反應(yīng)。隨著目前嗎啡濫用問題的日趨嚴重，對炎癥痛和神經(jīng)病理性痛的機制進行深入探索尤為重要。細菌、病毒和真菌等病原體感染常常引起疼痛，包括自發(fā)性的防御反射和痛覺過敏。然而由活體病原菌入侵和細菌感染導致的疼痛機制目前還不清楚，針對病原菌引起的疼痛也還沒有相應(yīng)的措施。

炎癥和感染可以降低局麻藥比如利多卡因的藥效，主要是通過結(jié)合神經(jīng)元膜以及使細胞酸化來中和局麻藥的作用。而非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥因為可以降低免疫系統(tǒng)對抗病原菌的能力而作為某些細菌感染的禁忌藥。因此，尋找既能治療疼痛又不影響宿主的抵抗力的鎮(zhèn)痛藥非常必要。

革蘭氏陽性病原菌—耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 是導致人們皮膚和軟組織感染的首要病因，可以產(chǎn)生疼痛性癤腫、膿腫、骨髓炎和蜂窩組織炎。MRSA菌株在社區(qū)和醫(yī)院的感染率越來越高，抗生素耐藥性的問題日益受到關(guān)注，因此需要新的方法來治療MRSA感染。MRSA產(chǎn)生許多毒性因子，包括對細菌在宿主中傳播和存活起關(guān)鍵作用的三種分泌性穿孔毒素(PFTs)：alpha-溶血素(Hla)、酚溶性調(diào)質(zhì)(PSMs)和雙組分白介素(HlgAB)。作者近期的研究發(fā)現(xiàn)MRSA通過N-甲?；嚯暮虷la可以使感覺神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流而直接激活神經(jīng)元，導致不依賴于免疫系統(tǒng)的疼痛(Nature 2013)。與野生型MRSA相比，Hla突變體引起的熱和機械痛敏降低。雖然這些結(jié)果有助于了解疼痛的潛在分子機制，但以往的研究并沒有涉及活的病原體入侵過程中所產(chǎn)生的疼痛，也就是說活細菌感染過程中產(chǎn)生的自發(fā)性疼痛機制還并不清楚。

該研究闡明了MRSA的毒力決定因子agr以及對PFTs的調(diào)控是感染過程中激活神經(jīng)元的關(guān)鍵機制。除了以前就證明的Hla之外，該研究還發(fā)現(xiàn)了另外一些PFTs，比如PSMs和HlgAB，都能使小鼠產(chǎn)生疼痛；這些毒素還能直接誘導神經(jīng)元鈣離子的內(nèi)流和動作電位的爆發(fā)；MRSA感染過程中的自發(fā)性疼痛依賴于agr和Hla；而DRG神經(jīng)元的TRPV1陽離子通道介導感染過程中的熱痛覺過敏；QX-314可以抑制PFTs誘導的神經(jīng)元活化，既能長期阻斷疼痛又不影響MRSA感染過程中宿主對細菌的清除力?？傊?，該研究闡明了MRSA感染過程中產(chǎn)生疼痛的幾種分子機制，證明QX-314是一種有效的阻斷感染引起的疼痛的鎮(zhèn)痛藥物。

2.主要研究方法

本文作者采用活的MRSA菌株USA300、USA500、紐曼菌株、毒力調(diào)控基因位點突變(△agr)的USA300以及三類PFTs各個位點突變的USA300菌株感染C57BL/6小鼠，然后檢測自發(fā)痛，機械痛、熱痛及腳掌的腫脹程度。以鈣成像技術(shù)檢測細菌是否直接激活DRG神經(jīng)元并引起鈣內(nèi)流。采用離體多通道記錄技術(shù)檢測被感染小鼠DRG神經(jīng)元的放電情況，進一步分析PFTs中的哪個因素對疼痛是必要的。使用藥理學方法將RTX及QX-314注射于小鼠，觀察TRPV1感受器失活后自發(fā)痛及熱痛的變化，及QX-314對于痛行為及神經(jīng)元放電的影響。

3.主要研究結(jié)果

為了研究感染過程中的疼痛，作者在小鼠腳底皮下注射不同劑量的USA300 (5×106- 5×108CFU)，一種毒性很強的社區(qū)獲得性MRSA，也是美國皮膚和軟組織感染的主要病原菌。觀察細菌感染后1 h內(nèi)小鼠自發(fā)性抬腳、舔爪和抖腳等自發(fā)痛行為，小鼠的這些行為被認為可以代表人嚴重細菌感染后立即出現(xiàn)的自發(fā)痛和銳痛。高劑量USA300感染可在數(shù)分鐘內(nèi)誘發(fā)強烈的自發(fā)痛行為，20～30 min達到高峰，持續(xù)60 min。低劑量不會引發(fā)自發(fā)痛。高溫滅活的細菌感染后不產(chǎn)生自發(fā)痛，說明自發(fā)痛依賴于活的病原體。各個劑量的細菌均會產(chǎn)生機械痛和熱痛。機械痛和熱痛4～6 h達高峰，低劑量USA300引起的機械痛持續(xù)時間較長(120 h)，高劑量持續(xù)時間短(24 h)。而熱痛正好相反，低劑量持續(xù)時間較短，高劑量持續(xù)時間長。腳爪腫脹和損傷程度也和細菌接種量有關(guān)。以上結(jié)果提示，MRSA感染可引起即刻的、劑量依賴性的自發(fā)痛以及持續(xù)數(shù)天的機械痛敏和熱痛敏。

隨后，作者比較幾種MRSA感染后產(chǎn)生疼痛的能力。兩種流行的MRSA菌株USA300和USA500感染后均產(chǎn)生了顯著的、程度相似的自發(fā)痛，但對甲氧西林敏感的紐曼菌株，其表達的毒力因子水平低于前兩種菌株，產(chǎn)生的自發(fā)痛程度與對照的PBS組無差別。這些數(shù)據(jù)表明疼痛可能與毒力因子的表達有關(guān)。而如果把毒力因子agr基因位點突變，(△agr) USA300引起的自發(fā)痛則消失，但是小鼠組織的細菌擴增量相同。表明由agr決定的細菌毒力而不是細菌擴增水平影響了自發(fā)痛。為了檢測MRSA是否直接激活神經(jīng)元，用原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元進行鈣成像實驗。USA300與原代DRG細胞共培養(yǎng)15 min引起了強烈地鈣內(nèi)流，許多細菌激活的神經(jīng)元也可被辣椒素（TRPV1激動劑）激活，說明這些神經(jīng)元是傷害性感受器神經(jīng)元。激活的神經(jīng)元的百分比與細菌濃度成量效關(guān)系，高濃度的細菌激活了將近100%的神經(jīng)元，而由突變的Δagr USA300激活的神經(jīng)元明顯減少，說明MRSA激活神經(jīng)元的能力依賴于agr，而agr介導了MRSA感染引起的自發(fā)痛和神經(jīng)元的鈣內(nèi)流。

PFTs決定了細菌在宿主組織內(nèi)的毒性，而agr系統(tǒng)是MRSA表達PFTs的主要調(diào)控因子。MRSA產(chǎn)生三類PFTs，包括：Hla，PSM和HlgAB。為了驗證傷害性神經(jīng)元上是否表達PFTs受體，作者分析了不同DRG神經(jīng)元亞群，包括IB4+/Nav1.8+，IB4-/Nav1.8+和Parvalbumin+細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元上表達Hla，HlgAB和PSM的受體（它們分別是Adam10，Darc和Fpr2）。那么MRSA的PFTs是否可以直接誘導神經(jīng)元放電呢？作者通過多電極陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)Hla，PSM和HlgAB均能引起神經(jīng)元放電。Hla，PSMα3和δ毒素（另一種PSM）注射小鼠體內(nèi)產(chǎn)生劑量依賴性的自發(fā)痛行為。而無法聚集成孔的單一組分HlgA，則不會產(chǎn)生疼痛。為了排除毒素造成的細胞溶解引發(fā)的放電，將神經(jīng)元培養(yǎng)基與三種PFTs以及活的USA300共孵育15 min后觀察乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，結(jié)果并沒有觀察到(LDH)顯著釋放，說明沒有細胞毒性的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明三種不同類型的MRSA的PFTs (Hla，PSMα3和HlgAB)都足以迅速地使神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，并使小鼠產(chǎn)生自發(fā)痛。

為了檢測不同的PFTs在MRSA引起疼痛中的必要性以及它們是否在疼痛中扮演特定的角色， 研究者使用不同的突變PFTs細菌檢測疼痛。研究發(fā)現(xiàn)單獨突變HlgAB不影響自發(fā)痛，但是將Hla和HlgAB一起突變或單獨突變Hla都明顯抑制自發(fā)痛，突變Hla的USA300所引起辣椒素反應(yīng)陽性神經(jīng)元也明顯減少。單獨突變PSMs 的某一位點(△psmα△psmβ△hld)并不影響自發(fā)痛，如果突變所有的PSMs有降低自發(fā)痛趨勢但是影響也比較小。組織腫脹程度都與突變沒有關(guān)系。以上數(shù)據(jù)證明了依賴于agr的PFTs (Hla, leukocidins, PSMs)可以直接誘導神經(jīng)元活化，并使小鼠產(chǎn)生自發(fā)痛。然而在活的細菌感染期間，只有Hla是必須的。

痛覺過敏發(fā)生較自發(fā)痛晚，持續(xù)時間卻長于自發(fā)痛。作者又對MRSA感染引起痛覺過敏的分子機制進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染突變agr的USA300，小鼠機械痛敏和熱痛敏并不受影響。TRPV1是一種由傷害性感受器表達的離子通道，可以被傷害性的熱激活，是炎癥性疼痛中熱痛過敏的關(guān)鍵介質(zhì)。為了證明TRPV1對MRSA感染引起的痛覺過敏的作用，使用樹酯毒素(RTX)處理小鼠，RTX可以去除TRPV1神經(jīng)纖維和神經(jīng)元。經(jīng)RTX處理的小鼠自發(fā)痛和熱痛明顯減少，機械痛敏則不受影響，這表明機械痛敏可能是由其他感覺神經(jīng)元亞群所介導。TRPV1基因敲除小鼠 的MRSA熱痛覺敏感明顯降低，機械痛和自發(fā)痛沒有變化。這些結(jié)果表明，表達TRPV1的傷害性感受器對于自發(fā)痛和熱痛敏是必要的，而TRPV1離子通道則僅僅參與MRSA感染引起的熱痛敏的形成。

鑒于PFTs是感染過程中疼痛發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)，作者希望根據(jù)這一機制找到有效的鎮(zhèn)痛方法。QX-314是一種帶正電荷的電壓門控鈉通道抑制劑，通常不能通透細胞膜。之前的研究表明，QX-314分子比較小，在大孔道陽離子通道打開時可以被送進傷害性感受器中從而產(chǎn)生長時程的鎮(zhèn)痛作用。那么細菌引起的疼痛和神經(jīng)元的激活導致神經(jīng)元細胞膜孔道的開放是否可使QX-314進入傷害性感受器，阻斷動作電位的產(chǎn)生、抑制疼痛呢？實驗發(fā)現(xiàn)Hla和PSMα3可引起DRG神經(jīng)元強烈的放電，應(yīng)用QX-314后可直接抑制動作電位的增加，說明QX-314可以進入神經(jīng)元。行為實驗也進一步驗證了QX-314通過PFTs產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。小鼠先注射Hla，然后15 min后注射2% QX-314，結(jié)果顯示自發(fā)痛行為明顯減少。以上結(jié)果說明了QX-314能強烈地抑制由MRSA的PFTs引起的神經(jīng)元放電和自發(fā)痛反應(yīng)。

最后，作者研究了QX-314是否可以阻斷USA300活細菌引發(fā)的疼痛并且比較了QX-314和其它鎮(zhèn)痛劑的效果。 因為QX-314是利多卡因的一種衍生物，作者首先比較了QX-314和利多卡因在治療MRSA引起的疼痛方面的療效。雖然利多卡因和QX-314 均明顯抑制MRSA引起的自發(fā)痛，QX-314還顯著性地抑制機械痛敏和熱痛敏，而利多卡因則對機械痛敏和熱痛敏完全無效。QX-314應(yīng)用于Trpv1基因敲除鼠，機械痛敏仍然可以被抑制，提示QX-314可能通過其他的機制進入神經(jīng)元。另外一種臨床上廣泛應(yīng)用的非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥布洛芬可通過抑制環(huán)氧化酶介導的前列腺素的合成治療炎癥性疼痛。然而它對細菌引起的疼痛的療效尚未明確。兩種劑量的布洛芬，包括人類最大推薦劑量(40 mg/kg)，均不能阻斷小鼠MRSA感染后的機械痛敏。由于利多卡因和布洛芬鎮(zhèn)痛效果不佳，QX-314有希望應(yīng)用到臨床治療感染性疼痛，且實驗結(jié)果表明QX-314每次注射后均能產(chǎn)生有效地并長達數(shù)小時的鎮(zhèn)痛作用。此外QX-314并不影響小鼠感染后的細菌負荷情況，表明鎮(zhèn)痛并不會消減宿主抵抗MRSA的能力。這些數(shù)據(jù)都表明QX-314是治療感染性疼痛的有效方法。

4.討論

疼痛是許多細菌感染如皮膚膿腫、齲齒和尿道感染的特征之一。然而，很少有研究探討活病原體侵襲過程中產(chǎn)生疼痛的分子機制。該研究結(jié)果表明，MRSA的幾種類型的PFTs可通過直接誘導神經(jīng)元鈣內(nèi)流和動作電位發(fā)放產(chǎn)生疼痛。鑒于這些毒素在細菌病原體中普遍存在，它們可能是細菌感染期間引起疼痛的一種基本機制。

由于利多卡因鎮(zhèn)痛作用容易被感染和炎癥所中和，因此開發(fā)治療感染期間的疼痛的方法非常有必要。該研究發(fā)現(xiàn)利多卡因?qū)RSA誘導的機械或熱痛敏沒有影響，布洛芬即使在最大推薦劑量(40 mg/kg)下，對MRSA引起的疼痛也沒有影響，而QX-314能立即阻滯由PFTs引起的神經(jīng)元激活，并能即刻并長時程地抑制MRSA引起的自發(fā)痛和痛覺過敏。

人們常常用小鼠來研究各種MRSA感染（如皮膚感染、肺部感染、菌血癥）的發(fā)病機制。在本文獻中作者使用皮下注射MRSA皮膚感染的小鼠模型（代表人類蜂窩織炎或膿腫的形成）來研究感染引起的疼痛，對于具有免疫能力的小鼠來說，通常需要大量的細菌才能引起皮膚感染（1×107-1×109CFU），而在人類中，較小的接種量可能導致嚴重的感染。在這個實驗中使用的細菌的接種量與其他報道是一致的。使用小鼠感染模型有一些注意事項，包括白介素受體的物種特異性差異（例如，C5a受體在小鼠中不與PVL結(jié)合），以及分泌的抑制人類先天防御系統(tǒng)的金黃色葡萄球菌因子之間的非相關(guān)性。盡管有這些警示，這項研究中證實的疼痛機制仍然可能與人類感染期間的疼痛機制相關(guān)。而且這項研究模擬的是急性MRSA皮膚感染，人類皮膚慢性感染（如特應(yīng)性皮炎） 是否可能具有類似的神經(jīng)元激活機制仍需要在今后的研究中得到證實。

活病原菌感染產(chǎn)生的自發(fā)痛反應(yīng)可能代表了病人在感染期間所經(jīng)歷的劇痛，尤其是在細菌負荷最高的感染高峰期。為了觀察這一現(xiàn)象，作者使用大劑量的MRSA（5×108CFU），但該劑量仍在引起皮膚感染模型的細菌使用范圍之內(nèi)。實驗期間(60 min)大量的細菌局部集中引起的毒素濃度與入侵高峰期相似。此外，自發(fā)痛發(fā)生在15 min內(nèi)，這個時間段小鼠對疼痛沒有適應(yīng)，可以在不同的小鼠上得到一致的實驗結(jié)果，而30 min后小鼠的自發(fā)痛下降它們會出現(xiàn)間歇性睡眠。盡管有以上這些需要注意的地方，但作者認為這項實驗仍然可以幫助我們明確細菌感染介導自發(fā)痛的關(guān)鍵因素。

agr是一種調(diào)控PFTs表達的毒性決定基因，它對感染過程中的自發(fā)痛至關(guān)重要，這與高水平的毒性因子會誘發(fā)疼痛的假說相吻合。該實驗發(fā)現(xiàn)三種 類 型MRSA的PFTs，Hla、HlgAB和PSMs可以直接誘導神經(jīng)元放電和疼痛。Hla和HlgAB以單體的形式分泌后停靠在細胞膜上，寡聚形成孔洞，允許陽離子進入哺乳動物的細胞中。PSM是肽類PFTs，同樣也會誘發(fā)鈣內(nèi)流，但PSM形成的孔隙結(jié)構(gòu)尚未完全闡明。哺乳動物宿主細胞識別PFTs后會啟動自噬和其他修復機制，由于膜的修復使得形成的孔隙時間比較短，在關(guān)閉前允許一些陽離子進入，這一過程可以解釋MRSA不同的PFTs誘導的神經(jīng)元放電動力學的差異。鑒于PFTs溶解細胞的性質(zhì)，探討感染是否會導致傷害性感受器神經(jīng)終末的永久性損傷或神經(jīng)元的失活，從而導致長期疼痛將是很有趣的。

MRSA的PFT之間的相互作用也可能導致疼痛。Berube等人發(fā)現(xiàn)缺乏PSM USA300 （特別是PSMα和Hld突變體）的細菌3 h內(nèi)產(chǎn)生的Hla明顯減少，但6 h可以恢復至正常水平。作者選擇的細菌接種時間可能正好在這兩個時間點之間，因此觀察到PSM缺陷菌株產(chǎn)生的自發(fā)痛有下降的趨勢，但與PBS組無差異，這一現(xiàn)象可以用USA300產(chǎn)生的Hla下降來解釋。

該實驗還證實在活的MRSA感染期間有不同的痛行為（自發(fā)痛、熱痛敏和機械痛敏）產(chǎn)生。TRPV1離子通道在細菌感染的過程中介導熱痛覺過敏，而不是自發(fā)痛。TRPV1能夠識別傷害性熱、辣椒素和質(zhì)子(H+)，細菌感染引起酸中毒，質(zhì)子可直接激活TRPV1；細胞因子通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)介導TRPV1的致敏；細菌前驅(qū)酶、氧化介質(zhì)和免疫細胞在炎癥過程中釋放的細胞因子都可能介導TRPV1致敏，還有一些其他的介導 TRPV1致敏的機制還需要進一步研究，同時作者還沒有考慮到在感染過程中其他離子通道或受體的參與。

QX-314是一種不通透膜的帶正電荷的鈉通道阻滯劑。實驗發(fā)現(xiàn) QX-314能有效抑制MRSA引起的自發(fā)痛和痛覺過敏。以往研究證實TRPV1和TRPA1這些陽離子通道的開放形成的瞬態(tài)孔隙可以將QX-314送進傷害性感受器中。最近，紀如榮實驗室發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白，細菌激活A(yù)纖維神經(jīng)元的一種成分，聯(lián)合QX-314治療可以緩解神經(jīng)病理性疼痛。TRPV1的內(nèi)徑約 6.8?，足夠讓QX-314通過，而由PFTs形成的孔道比TRPV1大(Hla: 15?34；leukocidins: 20-30?49)。未來的工作將探索QX-314在細菌感染期間進入神經(jīng)元的確切機制。盡管作者還沒有確定這些機制，但QX-314對疼痛有高效、持久的抑制作用這一發(fā)現(xiàn)很重要。

穿孔毒素是除MRSA外許多細菌病原體的主要毒性因素。但PFTs是否與其他致病菌產(chǎn)生的疼痛機制有關(guān)需進一步的證實。作者實驗室的工作證明了PFTs的長度和大小是不相關(guān)的，因為大的beta-桶狀毒素(Hla，HlgAB)和短的兩親性肽毒素(PSMs)都可以引起神經(jīng)元放電和疼痛。鑒于PFTs是一種具有高度破壞性的藥物，傷害性感受器會感知它們的存在，這可能是一種重要的機制去警告宿主病原體的存在。

炎癥性疼痛的臨床前研究通常使用完全弗氏佐劑或卡拉膠，但這不能代表人類疼痛的病理生理學誘因。細菌脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白和來源于真菌的酵母聚糖注射后都容易引起感染，然而，病原體除了這些成分外，還產(chǎn)生許多毒性因子，其中有一些不易純化、合成或儲存（例如熱不穩(wěn)定毒素），因此，研究活的病原體感染引起的疼痛機制，以及研究感染狀態(tài)下鎮(zhèn)痛藥的療效是很有必要的。一些課題組已經(jīng)開始了這項工作。Klumpp等研究表明，尿路致病性大腸桿菌產(chǎn)生的盆腔超敏反應(yīng)依賴于脂多糖和TRPV1。Farmer等人證實了經(jīng)陰道反復感染的白色念珠菌會導致小鼠出現(xiàn)強烈的機械異位性疼痛。

總之，本研究探討了幾種活的MRSA細菌感染產(chǎn)生疼痛的關(guān)鍵分子機制；并認為QX-314是一種有效的鎮(zhèn)痛藥物，可以在感染期間抑制自發(fā)痛、熱痛敏和機械痛敏。