人參皂苷Rg1促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖與分化

徐國超，高 巖，馬 爽，賈勝男，邱 晴，王 鈺，霍洪亮

(1.長(zhǎng)春市職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024；3.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

骨骼肌是構(gòu)成人體結(jié)構(gòu)的重要組成部分，具有維持軀體姿勢(shì)、產(chǎn)生軀體運(yùn)動(dòng)和參與能量代謝等多種生理功能[1-3].在軀體運(yùn)動(dòng)過程中或者某些病理?xiàng)l件下，骨骼肌容易受到損傷或者產(chǎn)生代謝障礙[4-5].骨骼肌屬于終末分化細(xì)胞，不能進(jìn)行補(bǔ)償性增殖，損傷后只能通過蛋白質(zhì)合成調(diào)控和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)行修復(fù)[6-7].人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，[8-9]具有抗癌、抗輻射和抗衰老等功能[10].有關(guān)人參皂苷Rg1對(duì)骨骼肌發(fā)育、增殖和分化調(diào)控作用的報(bào)道較少.為此，本文探討了人參皂苷Rg1對(duì)骨骼肌增殖、分化的影響，本研究對(duì)開展受損骨骼肌治療與修復(fù)，提高骨骼肌機(jī)能具有重要的臨床意義.

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；胰蛋白酶(北京鼎國生物公司)；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1，武漢艾美捷公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Cat#P1200，北京索萊寶生物公司)；單克隆抗兔MyoG抗體(英國Abcam公司)，單克隆抗鼠MyHC抗體(英國Abcam公司)，單克隆抗鼠β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物公司)；二甲基亞砜(DMSO，北京鼎國生物公司)；人參皂苷Rg1(上海源葉生物公司)；細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒(美國Sigma公司).

1.2 細(xì)胞系

小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞 (美國模式菌種收集中心).

1.3 噻唑藍(lán)比色法(MTT)

收集C2C12細(xì)胞，按照10 000個(gè)/mL的密度取200 μL接種于96孔板內(nèi)，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞完全貼壁后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)基處理12 h.按照空白組、不同濃度人參皂苷Rg1組分別處理48 h，加入20 mL 0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h.每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min.待MTT-甲臜結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)D(490)值.

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

C2C12細(xì)胞按1 000 000個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，細(xì)胞完全貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h.按空白組、IGF-1處理組和人參皂苷Rg1處理組培養(yǎng)48 h，加入EDU試劑(10 μmol/L)處理4 h.按照EDU檢測(cè)試劑盒說明，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞.用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞.用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min.用含1% BSA的PBS緩沖液再洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞加入EDU反應(yīng)混合物中，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.5 蛋白質(zhì)印跡法

將C2C12細(xì)胞超聲破碎，分別加入磷酸酶抑制劑A和B，4℃條件下16 000 r/min離心10 min.吸取上清100 μL移至EP管中，加入等量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液.沸水煮蛋白樣品5～10 min，使蛋白變性.上樣，120 V電泳30 min.取出凝膠，蒸餾水沖洗.取與凝膠大小相同的PVDF膜，在甲醇中潤(rùn)濕，以1張海綿、3張濾紙、凝膠、1張PVDF膜、3張濾紙、1張海綿平放并夾緊，置于冰盒中，加入冷轉(zhuǎn)膜液800 mL，連通電泳儀，100 V恒壓處理1 h.轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后，將PVDF膜放入封閉液中，4℃封閉過夜.封閉過后的PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，加一抗孵育2 h.TBST漂洗3次，加二抗，孵育1 h.用TBST漂洗3次.將印跡膜蛋白在全自動(dòng)顯影儀中顯影.利用Image Pro Plus6.0軟件進(jìn)行半定量分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性

人參皂苷Rg1孵育C2C12細(xì)胞48 h后，用10×20倍顯微鏡觀察、拍照，結(jié)果見圖1.由圖1可見，與空白組相比人參皂苷Rg1處理組細(xì)胞明顯增多.利用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果見圖2，與空白組相比人參皂苷Rg1處理組D(490)值呈濃度依賴性增加，并在濃度為0.01 mmol/L時(shí)達(dá)到最高，表明人參皂苷Rg1能夠促進(jìn)C2C12增長(zhǎng)并提高其活性.

a空白；b—e分別為0.0001，0.001，0.01和0.1 mmol/L人參皂苷Rg1處理，下同

圖2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

2.2 細(xì)胞增殖率

胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)對(duì)成肌細(xì)胞具有良好的促增殖作用.以IGF-1作為陽性對(duì)照，用0.01 mmol/L 人參皂苷Rg1孵育C2C12細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞的增殖率，結(jié)果見圖3.與空白組比較可見，人參皂苷Rg1處理組C2C12細(xì)胞的增殖率明顯升高，并且已接近IGF-1組，表明人參皂苷Rg1能夠顯著提高C2C12細(xì)胞的增殖率.

2.3 細(xì)胞分化

用人參皂苷Rg1孵育C2C12細(xì)胞，并用2%馬血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化，培養(yǎng)5 d后利用10×20倍顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，結(jié)果見圖4.與空白組比較可見，人參皂苷Rg1處理組細(xì)胞明顯變長(zhǎng)，細(xì)胞纖維化程度增強(qiáng)，細(xì)胞排列更加整齊，生長(zhǎng)更具有方向性.對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞長(zhǎng)度的增加呈濃度依賴性，表明人參皂苷Rg1能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的分化.

圖3 人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞增殖率的影響

圖4 人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

2.4 肌球蛋白重鏈(MyHC)表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證人參皂苷Rg1促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化的功能，將C2C12細(xì)胞用2%馬血清誘導(dǎo)，人參皂苷Rg1分別孵育3，5，7 d后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)MyHC的表達(dá)情況，結(jié)果見圖5.由圖5可見，人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性地提高C2C12細(xì)胞MyHC的表達(dá)量，0.01 mmol/L處理組效果最好.這種促進(jìn)效應(yīng)可以持續(xù)7 d以上，第7天MyHC相對(duì)表達(dá)量最高，說明在一定時(shí)間內(nèi)，隨著人參皂苷Rg1孵育天數(shù)的增多，對(duì)細(xì)胞MyHC表達(dá)的促進(jìn)作用也逐漸增強(qiáng).表明人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性、時(shí)間依賴性地促進(jìn)C2C12細(xì)胞終末分化標(biāo)志蛋白MyHC的表達(dá)，證明了人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞的促分化作用.

圖5 人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞肌球蛋白重鏈MyHC表達(dá)的影響

2.5 肌細(xì)胞生成素(MyoG)表達(dá)

骨骼肌成肌細(xì)胞分化受多種成肌分化因子調(diào)節(jié)[11]，其中MyoG在骨骼肌分化的后期起著關(guān)鍵性的作用，常用于骨骼肌分化標(biāo)志物的檢測(cè)[12-13].人參皂苷Rg1分別孵育C2C12細(xì)胞3，5，7 d后，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MyoG的表達(dá)水平，結(jié)果見圖6.由圖6可見，人參皂苷Rg1處理后MyoG表達(dá)水平都有不同程度的升高，且具有濃度依賴性.其中0.01 mmol/L處理組在不同時(shí)間梯度中MyoG相對(duì)表達(dá)量最好，分別是空白組的1.83，2.14和2.2倍.由此可見，人參皂苷Rg1能夠上調(diào)MyoG表達(dá)，再次證明Rg1對(duì)C2C12具有促進(jìn)分化的作用.

圖6 人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞中肌細(xì)胞生成素MyoG蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論

骨骼肌是人體動(dòng)力產(chǎn)生器官，不論是廢用性萎縮、衰老，還是病理性肌萎縮，都會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量造成極大的影響.目前，許多學(xué)者致力于研究安全有效的治療骨骼肌損傷的方法，其中，天然、無副作用的生物藥物越來越受到學(xué)者的關(guān)注.人參的抗腫瘤、抗氧化和保護(hù)心血管的作用已經(jīng)被人們所認(rèn)識(shí).人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，在增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)保護(hù)等方面都具有明顯的功效.

本文的研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1對(duì)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12的增殖與分化均具有良好的促進(jìn)作用.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1孵育的C2C12細(xì)胞數(shù)目明顯增多.細(xì)胞活力檢測(cè)表明，C2C12細(xì)胞活性與人參皂苷Rg1呈濃度依賴性增加，人參皂苷Rg1對(duì)提高C2C12細(xì)胞活力有促進(jìn)作用.人參皂苷Rg1對(duì)C2C12細(xì)胞增殖率的影響也很顯著，接近于胰島素樣生長(zhǎng)因子-1.

成人骨骼肌損傷修復(fù)是一個(gè)高度同步化的過程，成肌細(xì)胞經(jīng)過增殖、分化和融合形成新的肌纖維并重構(gòu)收縮功能.其中，成肌細(xì)胞分化為可收縮的肌纖維是一個(gè)非常重要環(huán)節(jié).成肌細(xì)胞分化受多種生肌調(diào)節(jié)因子調(diào)控，而肌細(xì)胞生成素(MyoG)是一個(gè)重要的促分化因子，在肌分化的早期參與正常肌管的形成.C2C12細(xì)胞經(jīng)人參皂苷Rg1孵育后，MyoG的表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)啟動(dòng)成肌細(xì)胞分化具有重要作用.肌球蛋白重鏈(MyHC)是成肌細(xì)胞分化末期的標(biāo)志性蛋白，人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性地增加MyHC的表達(dá)水平，促進(jìn)了骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12的分化.這些結(jié)果表明，利用人參皂苷Rg1孵育C2C12細(xì)胞，既能促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞活力，還能促進(jìn)細(xì)胞分化.本研究為骨骼肌受損后治療與修復(fù)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，也為如何提高運(yùn)動(dòng)人員的骨骼肌機(jī)能提供了新的思路和方法.