松香含氮衍生物對(duì)小地老虎四齡幼蟲(chóng)的拒食活性及構(gòu)效關(guān)系

翟兆蘭， 閆鑫焱， 許 吉， 宋湛謙， 商士斌， 饒小平,3*

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042； 2. 南京林業(yè)大學(xué) 林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037； 3. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，別稱(chēng)地蠶、切根蟲(chóng)、地剪，屬鱗翅目夜蛾科，分布廣泛，食性雜，且食量大。3齡后的小地老虎剪苗率高，會(huì)對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生重大危害[1]。目前，對(duì)小地老虎的防治方法主要是化學(xué)農(nóng)藥防治，然而殺蟲(chóng)劑長(zhǎng)期大量使用，不僅會(huì)使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性而且會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品安全問(wèn)題，從而危及人類(lèi)和動(dòng)物的健康[2-3]。隨著綠色環(huán)保理念的推廣，基于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)對(duì)無(wú)公害農(nóng)藥的迫切需求，人們不斷探索更加安全環(huán)保的害蟲(chóng)防治藥劑與方法[4-5]。昆蟲(chóng)拒食劑主要通過(guò)干擾昆蟲(chóng)的取食行為從而達(dá)到作物保護(hù)的目的，不會(huì)直接殺滅昆蟲(chóng)，具有使用安全、對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了廣泛的關(guān)注[5-8]。經(jīng)過(guò)改性的天然資源產(chǎn)物中的次生物質(zhì)是昆蟲(chóng)拒食劑的主要來(lái)源，例如萜類(lèi)、生物堿、酚類(lèi)、醌類(lèi)、香豆素類(lèi)、糖類(lèi)等不同類(lèi)型的化合物[8-10]。松香是我國(guó)特有的可再生林業(yè)資源，其主要成分樹(shù)脂酸具有獨(dú)特的三環(huán)二萜結(jié)構(gòu)，含有雙鍵和羧基2種官能團(tuán)，易于化學(xué)修飾。以松香為原料的產(chǎn)品豐富，廣泛應(yīng)用于國(guó)民生活的各個(gè)領(lǐng)域[11-13]。此外松香樹(shù)脂酸及其衍生物具有廣泛的生物活性，可用于生產(chǎn)具有抑菌、殺蟲(chóng)、抗腫瘤及抗病毒等生物活性的產(chǎn)品[10, 14-17]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)松香衍生物具有較好的拒食活性，Klejdysz等[18]合成的松香酸離子液體對(duì)鱟蟲(chóng)、赤擬谷盜蟲(chóng)和谷斑皮蠹等農(nóng)作物害蟲(chóng)具有較強(qiáng)的拒食效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，松香酯類(lèi)及酰胺類(lèi)衍生物對(duì)粘蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)等農(nóng)作物害蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食活性[19-20]。本研究探索了4種不同類(lèi)型的松香含氮衍生物(脫氫樅酸酰胺、脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿、脫氫樅酸?；螂搴投錁核狨；螂?對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性，以期篩選出具有高拒食活性的松香衍生物，為今后小地老虎的防治提供安全、環(huán)保的藥劑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1樣品

脫氫樅酸酰胺衍生物(1a～1i)、脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(2a～2j)、脫氫樅酸?；螂逖苌?3a～3e)和二氫樅酸酰基硫脲衍生物(4a～4h)根據(jù)文獻(xiàn)[21～22]的方法合成及提純，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。所得樣品用乙醇或丙酮配成10 g/L的母液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆?，試?yàn)前母液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的水溶液稀釋。

1.2供試靶標(biāo)及培養(yǎng)條件

小地老虎(Agrotisypsilon)在室溫為(25±1) ℃，相對(duì)濕度為(75±5)%和光照周期光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8,h∶h,下同)的室內(nèi)繼代人工飼養(yǎng)。選擇個(gè)體大小一致的小地老虎4齡幼蟲(chóng)供試。甘藍(lán)葉取自溫室人工栽培的甘藍(lán)，未接觸任何化學(xué)藥劑。

1.3松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食率測(cè)定

采用浸葉法進(jìn)行拒食活性的測(cè)定。將新鮮甘藍(lán)葉片用清水洗凈、自然晾干，用打孔器制備直徑2.0 cm、面積314 mm2的葉碟，將其放入1.0 g/L的藥液中浸泡10 s，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的水溶液作參照，自然晾干，放入12孔養(yǎng)蟲(chóng)板中，每孔放入1片葉碟，接入饑餓處理4 h且生長(zhǎng)一致的小地老虎4齡幼蟲(chóng)，每種處理重復(fù)10次。之后，將養(yǎng)蟲(chóng)板放置于溫度為(27±1) ℃、相對(duì)濕度為(75±5)%、光照周期為L(zhǎng)16∶D8的環(huán)境中飼養(yǎng)幼蟲(chóng)，24 h后取出殘存的葉碟，用1 mm × 1 mm標(biāo)準(zhǔn)方格紙測(cè)量葉碟的剩余面積計(jì)算拒食率。拒食率(%) =(對(duì)照組取食面積-處理組取食面積)/對(duì)照組取食面積×100%。

1.4松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食中濃度測(cè)定

將樣品母液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的水溶液稀釋配制成3～4個(gè)系列濃度，按照1.3節(jié)中的方法計(jì)算不同濃度的拒食率，拒食中濃度(AFC50)的計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[23]中的方法，將拒食率設(shè)為概率值y、松香含氮衍生物的濃度設(shè)成變量x，應(yīng)用DPS v7.05軟件模擬得到毒力回歸方程y=ax+b，并用該方程計(jì)算拒食率為50%時(shí)的樣品濃度，即AFC50。

圖1 松香含氮衍生物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 The molecular structure of rosin nitrogen derivatives

2 結(jié)果與討論

2.1松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食率

松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)拒食活性的10組實(shí)驗(yàn)取平均值得到取食面積，進(jìn)一步計(jì)算拒食率，結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為1.0 g/L的松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)無(wú)致死作用。由表1可以看出脫氫樅酸酰胺衍生物及脫氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食率均低于23%，對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)無(wú)明顯拒食作用。脫氫樅胺對(duì)氯水楊醛Schiff堿(2i)處理過(guò)的甘藍(lán)葉小地老虎的取食面積大大減少，在質(zhì)量濃度1.0 g/L時(shí)的拒食率為86.12%，較大地抑制了小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食；脫氫樅胺對(duì)甲氧基苯甲醛Schiff堿(2b)對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食率為52.04%，具有較強(qiáng)的拒食活性；其他脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的拒食率低于22%，未表現(xiàn)出對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性；并且2a、2d和2j對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食表現(xiàn)出促進(jìn)作用。二氫樅酸異丙醇?；螂?4b)的拒食率為85.13%，較大地抑制了小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食；二氫樅酸2-羥甲基-1,3-丙二醇?；螂?4c)和二氫樅酸呋喃酰基硫脲(4g)的拒食率分別為66.70%和50.48%，表現(xiàn)出對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)較強(qiáng)的拒食作用，其他二氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食無(wú)明顯抑制作用，拒食率均小于22%。

表1 松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食面積及拒食率

2.2松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食中濃度

由2.1節(jié)的結(jié)果可知脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2b和2i，二氫樅酸?；螂逖苌?b、4c和4g對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食作用，因此繼續(xù)測(cè)定了上述5種松香含氮衍生物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食面積和拒食率，結(jié)果列于表2。并由不同質(zhì)量濃度下的拒食率，應(yīng)用毒力回歸方程計(jì)算拒食率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，即拒食中濃度(AFC50)，相關(guān)結(jié)果列于表3。

表2 不同質(zhì)量濃度的松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食面積及拒食率

表3 松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)對(duì)小地老虎的拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)

由表2可得，5種松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性隨濃度的降低而降低。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2i在質(zhì)量濃度0.001 g/L時(shí)的拒食率為14.98%，仍具有一定的拒食活性，并且2i的AFC50值極低為0.04 g/L，其值遠(yuǎn)小于脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2b的AFC50(0.66 g/L)。二氫樅酸酰基硫脲衍生物4b同樣具有較低的拒食中濃度，為0.25 g/L；4c和4g的拒食中濃度分別為1.47和0.69 g/L。二氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性順序?yàn)?b>4g>4c。對(duì)照物梣酮對(duì)小地老虎2齡幼蟲(chóng)24 h的拒食率為42.8%，拒食中質(zhì)量濃度為13.40 g/L[24]，松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c的拒食中濃度均低于梣酮對(duì)小地老虎的拒食中濃度，說(shuō)明松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c對(duì)小地老虎均具有較好的拒食活性。

2.3松香含氮衍生物的結(jié)構(gòu)與其拒食活性的構(gòu)效關(guān)系

對(duì)比4類(lèi)松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿和二氫樅酸?；螂鍖?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性較高，脫氫樅酸酰胺和脫氫樅酸?；螂鍖?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性較弱。

對(duì)比10種不同的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性，化合物2b遠(yuǎn)大于2a，由圖1中的結(jié)構(gòu)式可以看出，化合物2b與2a相比僅多一個(gè)甲氧基，說(shuō)明甲氧基的引入大大提高了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性；2c和2g的拒食活性也大于2a，并且2c和2g的拒食活性相近，表明氯原子和羥基的引入增強(qiáng)了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性，并且氯原子和羥基的效果相近，將氯原子和羥基同時(shí)引入到脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿中得到2i，大大增強(qiáng)了對(duì)小地老虎的拒食活性，質(zhì)量濃度1 g/L時(shí)，2i對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食率為86.12%。2d、2e和2f的拒食活性與2a相近，說(shuō)明雖然氟原子與氯原子同為鹵素原子，但氟原子對(duì)脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性無(wú)明顯影響。甲氧基、氯原子和羥基對(duì)脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性具有明顯的增強(qiáng)作用，氯原子和羥基的同時(shí)引入更能大大提高其拒食活性。由8種二氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)拒食活性可以看出，4b和4c的拒食活性遠(yuǎn)大于4a，即羥基位置和個(gè)數(shù)的改變對(duì)二氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性有明顯的影響。4h的拒食活性大于4d，表明氟原子比甲基更能增強(qiáng)二氫樅酸?；螂逖苌飳?duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性。4g遠(yuǎn)大于4e和4f，說(shuō)明含有呋喃環(huán)的二氫樅酸?；螂逖苌锏木苁郴钚员群袉徇h(huán)和哌嗪環(huán)的好。

3 結(jié) 論

3.1研究了4種不同類(lèi)型的松香含氮衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性，篩選出5種具有較高拒食活性的松香含氮衍生物。其中2i和4b幾乎能完全抑制小地老虎4齡幼蟲(chóng)的取食，質(zhì)量濃度1 g/L時(shí)2i和4b24 h后的拒食率分別為86.12%和85.13%；2b、4c和4g的拒食率大于50%，對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)同樣具有較強(qiáng)的拒食活性。2i具有極低的拒食中質(zhì)量濃度 (AFC50)為0.04 g/L，2b、4b、4c和4g的AFC50分別為0.66、 0.25、 1.47和0.69 g/L。

3.2脫氫樅酸酰胺衍生物和脫氫樅酸酰基硫脲衍生物對(duì)小地老虎的拒食活性較弱且其結(jié)構(gòu)變化對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性的影響較小。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物和二氫樅酸酰基硫脲衍生物對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性較高，研究發(fā)現(xiàn)甲氧基、氯原子和羥基對(duì)脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿的拒食活性有明顯的增強(qiáng)作用；二氫樅酸?；螂逖苌镏辛u基的位置和個(gè)數(shù)對(duì)小地老虎4齡幼蟲(chóng)的拒食活性有明顯的影響。