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    和厚樸酚對乳腺癌4T1細(xì)胞小鼠肺轉(zhuǎn)移模型的影響

    2019-01-02 06:11:40
    西南國防醫(yī)藥 2018年12期
    關(guān)鍵詞:藥組空白對照培養(yǎng)基

    曾 敏

    癌癥因其高致死率,一直以來嚴(yán)重威脅著人類健康,傳統(tǒng)手術(shù)切除治療方法很難根治,隨后采取的放化療手段又給患者帶來巨大痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前,乳腺癌患者大多接受切除手術(shù)和化療結(jié)合的治療方案,能夠取得一定的預(yù)期療效[8]。但是,一旦發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,尤其是肺轉(zhuǎn)移后,傳統(tǒng)的治療方案效果欠佳,病死率很高。因此,尋找新的靶向低毒的抗轉(zhuǎn)移藥物已成為治療晚期乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)之一。和厚樸酚(honokiol)是從木蘭科植物厚樸中提取分離得到,具有較好的抗炎、抗菌、抗衰老和抑制腫瘤生長等作用[9]。因其為天然植物提取成分,相對合成化合物具有低毒、安全的優(yōu)點(diǎn),也越來越受人們關(guān)注。本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn),其對多種腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制作用。為此,本研究通過建立小鼠4T1肺轉(zhuǎn)移模型,以考察其對乳腺癌晚期肺轉(zhuǎn)移模型的治療效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料 和厚樸酚(由本課題組分離提取,經(jīng)HPLC檢測含量>98%);紫杉醇(四川太極制藥有限公司);4T1、B16F10、H460、H1975 細(xì)胞株(美國 ATCC細(xì)胞庫,由本課題組保種);RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司);胎牛血清(草原綠野生物制品有限公司);MTT(美國 Sigma 公司);Cleaved-Caspase3(美國 abcam 公司);Balb/c小鼠,SPF 級, 雌性,18~20 g(北京華阜康生物科技股份有限公司),實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2014-0004。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4T1、H460、H1975細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),B16F10細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),48 h傳代一次。待細(xì)胞長至80%融合時,用0.25%胰酶消化液消化,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 細(xì)胞半抑制率(IC50)測定 分別取4T1、B16F10、H460、H1975細(xì)胞懸液,按 3×104個/ml細(xì)胞密度鋪96孔板,每孔 100 μl,正常培養(yǎng) 24 h。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組和和厚樸酚給藥組:給藥組加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μM/L 的和厚樸酚, 空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72 h后,用MTT法測定細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。用Graph Pad Prism6.0軟件計算IC50,考察不同時間點(diǎn)和厚樸酚對細(xì)胞的抑制作用(n=6)。

    1.2.3 Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)測定 取4T1細(xì)胞懸液,按3×105個/ml細(xì)胞密度鋪6孔板,每孔2 ml,正常培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、溶劑對照組、陽性藥組和和厚樸酚給藥組:陽性藥組給予紫杉醇10 nM/L;和厚樸酚給藥組給予不同濃度和厚樸酚(0.4、0.8、1.6 μM/L);溶劑對照組給予同體積的空白溶劑;空白對照組不做處理。作用48 h后,提取總蛋白,用BCA試劑盒測定細(xì)胞的蛋白濃度。采用免疫印跡法(Wetern blotting)檢測 Cleaved-Caspase3蛋白[3-4]的表達(dá)水平[1-2]。實(shí)驗(yàn)步驟:每組取25 μg蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗4℃孵育(1∶1000)過夜,用 TBST 洗膜 2 次;換二抗(1∶2000)室溫孵育2 h,用TBST洗膜2次后,用化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影并采集圖像進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)采用GAPDH為內(nèi)參。

    1.2.4 肺轉(zhuǎn)移模型建立 取4T1細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至 2.5×105個/ml。 按 100 μl/鼠尾靜脈接種[5],次日開始分組給藥。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組和和厚樸酚給藥組,每組10只小鼠:空白對照組給予生理鹽水200 μl灌胃,1次/d;和厚樸酚給藥組給予和厚樸酚溶液 200 μl(200 mg/kg)灌胃,1 次/d。 每日觀察小鼠狀態(tài),并記錄生存結(jié)果。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料以±s表示,組間比較采用One-way ANOA方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IC50測定結(jié)果 和厚樸酚對各腫瘤細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用,且隨作用時間延長IC50也隨之降低(P< 0.05,表 1)。

    表1 和厚樸酚對細(xì)胞增殖的影響(n=6)

    2.2 和厚樸酚對4T1細(xì)胞Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較,0.4、0.8、1.6 μM/L的和厚樸酚作用48 h,能明顯增加細(xì)胞Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá),且強(qiáng)于陽性藥紫杉醇組,而溶劑對照組Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量沒有明顯變化。見圖1。

    圖1 各組4T1細(xì)胞Cleaved-Caspase3表達(dá)結(jié)果比較

    2.3 生存率考察結(jié)果 在接種4T1細(xì)胞后,空白對照組在接種第10 d時便開始有小鼠死亡,且在第14 d后小鼠開始死亡增多,第18 d時已無小鼠存活。與空白對照組比較,和厚樸酚給藥組在接種第24 d時才有1只小鼠死亡,第40 d后小鼠開始陸續(xù)死亡,中位生存期為58 d(圖2)。

    圖2 和厚樸酚對乳腺癌4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠生存率的影響

    3 討論

    近年來,中藥活性成分用于抗腫瘤的研究日益增多,因其低毒、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢而廣受青睞。和厚樸酚作為常用中藥厚樸的有效成分,其來源較廣,獲得相對容易,且藥理作用面較廣,具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。由本研究結(jié)果(表1)可以看出,和厚樸酚對幾株腫瘤細(xì)胞的IC50均小于30 μM/L(72 h),表現(xiàn)出良好的抑制效果。表明和厚樸酚對腫瘤細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,且對人源(H460、H1975)和鼠源(4T1、B16F10)細(xì)胞珠均有較好抑制作用,并存在一定的時間依賴關(guān)系。免疫印跡結(jié)果(圖1)也表明,和厚樸酚對凋亡促進(jìn)相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3的表達(dá)有明顯上調(diào)作用,提示其能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。

    在癌癥發(fā)展過程中,晚期患者常會出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的情況,從而導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化,給患者和治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究通過尾靜脈接種乳腺癌4T1細(xì)胞,入血后會自發(fā)轉(zhuǎn)移至肺部,來模擬乳腺癌晚期肺轉(zhuǎn)移情況[10]。結(jié)果接種后,未經(jīng)藥物治療的小鼠會很快死亡(空白對照組小鼠中位生存期僅為18 d),解剖后可發(fā)現(xiàn)小鼠肺部有大量4T1細(xì)胞聚集。給藥組通過200 mg/kg劑量的和厚樸酚干預(yù)治療,與空白對照組比較,小鼠開始出現(xiàn)死亡和無小鼠存活時間明顯延長,中位生存期達(dá)58 d,表明和厚樸酚對小鼠肺轉(zhuǎn)移模型有較好的治療效果。

    綜上所述,和厚樸酚能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生長有較好抑制作用,具有較大的開發(fā)利用價值。

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