異體淋巴細胞和自體淋巴細胞序貫局部注射對小鼠肝癌移植瘤的治療作用

徐 兵 黃素欽 吳林嵐 魏建威 楊曉梅 趙芝萍 陳 怡 蔣曉織

已知注射異體淋巴細胞(Heterogeneic lymphocyte，HL)可誘發(fā)荷瘤受者產(chǎn)生移植物抗腫瘤效應(GVTE)和宿主抗腫瘤效應(HVTE)等免疫反應[1-3]。但由于注射的HL會被受者免疫系統(tǒng)破壞，且HL會引發(fā)移植物抗宿主反應(GVHE)，使得GVTE臨床應用受限。目前報道的對策主要是減少HL對宿主的損害(比如清除反應性T細胞，用60Co照射降低供者HL活力[9]，用絲裂霉素滅活供者HL[10])，或誘導受者產(chǎn)生免疫耐受[4-8]。本文借鑒常用的血管外動物免疫方式，先將HL注射移植到受者荷瘤組織局部，激活受者自體淋巴細胞(Autogeneic lymphocyte，AL)免疫反應，然后采集受者被激活的AL回輸?shù)胶闪鼋M織局部，發(fā)揮自身免疫抗腫瘤功能。本研究初步證明了本法的可行性和有效性，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要器材

用CB6F1(BABL/c×C57BL/6，H-2d/b)小鼠作受體鼠(受鼠)，用CC3HF1(BABL/c×C3H，H-2d/k)小鼠作供體鼠(供鼠)。供鼠與受鼠均為雌性，10周齡，淋巴細胞H-2為半相合；供鼠與受鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司(動物合格證號SCXK(京)2006-009)。Hepa 1-6肝癌細胞株(H-2b)購自中國科學院細胞庫。豬凝血酶和纖維蛋白膠注射裝置購自廣州倍繡生物技術(shù)公司。

1.2 荷瘤受鼠的制備

將Hepa 1-6細胞解凍復蘇后，用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的Hepa 1-6細胞用無血清DMEM培養(yǎng)液配成4×106/mL細胞懸液，并取0.1 mL注射到受鼠右腹股溝皮下組織為荷瘤受鼠。接種后6 d全部荷瘤受鼠腹股溝均可觸及腫瘤，平均瘤體積約18 mm3，成瘤率100%。而后每隔3 d用游標卡尺測瘤的長徑(a)和寬徑(b)，計算瘤體積(V=ab2/2)。

1.3 HL和AL的制備

取供鼠、受鼠脾分別制備HL、AL(或同組同基因小鼠淋巴細胞)。將小鼠脫頸處死，手術(shù)取脾，用PBS洗一次，放于尼龍篩網(wǎng)上，用鑷子邊梳刮邊加入無血清DMEM培養(yǎng)液至3 mL；加入紅細胞裂解液(取氯化銨3.73 g、三羥甲基氨基甲烷Tris 1.3 g加水溶解并稀釋至500 mL，0.22 μm孔徑濾器過濾除菌)溶解紅細胞，靜止5 min，離心(1 000 rpm/min，10 min)去上清，再以無血清DMEM重懸細胞，同法離心洗滌3次。沉淀用PBS重懸為AL(4 g/L臺盼藍拒染法測細胞活率大于95%)。

1.4 小鼠血漿纖維蛋白膠(FG)組分Ⅰ、Ⅱ的制備

組分Ⅰ(血漿冷沉淀)：取20 mL小鼠血漿置-30℃冷凍12 h，然后在4℃解凍6～12 h，4℃下離心(2 000 rpm/min，15 min)，吸出上清液，留底部約1 mL沉淀物。組分Ⅱ(酶鈣溶液)：取500 U豬凝血酶溶于2 mL 40 mmol/L氯化鈣溶液。組分Ⅰ和Ⅱ等量混合即為FG。FG與HL或AL的應用組合稱為FG-HL或FG-AL。

1.5 FG-HL和FG-AL序貫局部注射療法

序貫療法分為前、后兩階段。前階段給受鼠注射HL為實驗組，方法是在接種瘤細胞后3 d，隨機取荷瘤受鼠，在右下腹腔靠近移植瘤部位注射FG-HL；對照組用同法注射FG-磷酸鹽緩沖液(FG-PBS)；而后檢測兩組受鼠免疫指標變化。后階段取實驗組、對照組受鼠脾淋巴細胞(SL或AL)，將FG-AL注射到本組其余受鼠右下腹腔內(nèi)靠近移植瘤部位。FG-HL或FG-AL要在注射后才形成FG凝膠包埋HL或FG凝膠包埋AL。

實驗組方法：取200 μL濃縮血漿與200 μL HL懸液混合(終細胞數(shù)24×107)，為成分Ⅰ；取390 μL酶鈣溶液(含50 U豬凝血酶和20 mg氮卓酮)與10 μL 0.25%胰蛋白酶溶液混勻為成分Ⅱ。在接種瘤細胞后3 d，隨機取荷瘤受鼠，將成分I(400 μL)和成分Ⅱ(400 μL)各吸入一注射器，兩個注射器終端合用一管道和針頭，可同時或分別交替注射，將兩種成分混合注射到受鼠右下腹腔局部(每鼠0.1 mL，細胞數(shù)3×107)為實驗組(n=16)。對照組(n=16)用FG-PBS，在同樣部位同法注射。首次注射后5 d、10 d，兩組受鼠均分別按上述方法再注射1次。第3次注射后5 d從兩組分別隨機取8只受鼠，4只用來取脾淋巴細胞組合成FG-AL(同F(xiàn)G-HL組合法，含AL 9×107/0.1 mL)，4只用于測免疫功能。將各組的FG-AL分別注射到本組其余8只受鼠右下腹腔局部。兩組受鼠均在末次注射后10 d處死，剝出皮下移植瘤，測瘤的長徑(a)和與之垂直的寬徑(b)；計算腫瘤體積(V=ab2/2)和腫瘤生長抑制率(抑瘤率%)(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.6 荷瘤受鼠脾淋巴細胞(SL或AL)對肝癌細胞的殺傷實驗

在前階段治療后3 d，從實驗組和對照組分別隨機取4只受鼠，制備脾淋巴細胞(效應細胞，E)。將E與Hepa 1-6瘤細胞(靶細胞，T)按不同的E：T(數(shù)量比)混合，體外培養(yǎng)。用乳酸脫氫酶(LDH)法測淋巴細胞殺瘤細胞率(殺瘤率)。殺瘤率(%)=[(實驗組釋放值-靶細胞自發(fā)釋放值)/(靶細胞最大釋放值-靶細胞自發(fā)釋放值)]×100%。

1.7 用流式細胞術(shù)檢測荷瘤受鼠脾淋巴細胞亞群

用1.6獲取的實驗組、對照組受鼠淋巴細胞，按流式細胞法加入FITC-CD8抗體、FITC-CD-49/Pan NK抗體，測兩組的CD8+T和NK細胞數(shù)量。

1.8 用ELISA法檢測荷瘤小鼠血清IL-2、INF-γ濃度

用1.6獲取的實驗組、對照組受鼠血清，按ELISA試劑盒說明書測兩組的血清IL-2、IFN-γ濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 FG-HL注射增強了荷瘤受鼠AL對肝癌細胞殺傷力

前階段注射FG-HL治療后，實驗組AL的殺瘤細胞率(26.70±7.22)%明顯高于對照組的殺瘤細胞率(5.70±2.68)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表1)。

表1 實驗組和對照組受鼠的淋巴細胞殺瘤細胞率

2.2 FG-HL注射增加了荷瘤受鼠脾淋巴細胞(SL或AL)、CD8+T細胞和NK細胞數(shù)量

前階段注射FG-HL治療后，實驗組受鼠的SL或AL數(shù)(25.60±5.98)、CD8+T細胞數(shù)(0.84±0.14)、NK細胞數(shù)(0.49±0.09)均明顯高于對照組相應值(12.40±2.48、0.55±0.04、0.29±0.05)，配對數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 實驗組和對照組受鼠脾淋巴細胞、CD8+T細胞、NK細胞數(shù)量

Note：Mice in the experiment group were injected with FG-HL on the tumor-bearing tissues.

2.3 FG-HL注射使荷瘤受鼠血清IL-2和INF-γ濃度增高

前階段注射HL治療后，實驗組受鼠的血清IL-2和IFN-γ濃度明顯高于對照組相應值(P<0.01)(表3)。

2.4 荷瘤組織局部序貫注射FG-HL和FG-AL對受鼠肝癌移植瘤的治療作用

在接種瘤細胞后28 d，經(jīng)前階段注射FG-HL和后階段注射FG-AL治療(共25 d)，受鼠經(jīng)荷瘤組織局部序貫注射HL和AL治療(實驗組)或注射PBS(對照組)后，移植實驗組受鼠的瘤平均體積(1.20±0.33)cm3明顯小于對照組瘤平均體積(2.05±0.37)cm3(P<0.01)；實驗組的抑瘤率為41.5%。

FactorsE(n=8)C(n=8)tPIL-2(pg/mL)28.60±7.438.50±2.717.452<0.01IFN-γ(pg/mL)147.80±34.5914.90±1.5515.80<0.01

Note：Experiment group were injected with FG-HL on the tumor-bearing tissues.

3 討論

將同種異體淋巴細胞(HL)輸入白血病或?qū)嶓w瘤患者(宿主)后，HL既可攻擊受者正常細胞(移植物抗宿主反應GVHE)和癌細胞(移植物抗腫瘤反應GVTE)，也可激活受者自體淋巴細胞(AL)攻擊癌細胞(宿主抗腫瘤反應HVTE)。這種AL抗腫瘤作用特異性強，較安全，是最有希望清除癌細胞的生物療法。為了減少HL對受者正常細胞的損傷，文獻的方法是滅活或部分滅活HL[5-10]，但這也會降低HL的免疫刺激作用。本文將活的HL或AL包裹于FG凝膠中，使這兩種淋巴細胞能大體定位在所注射部位或瘤灶部位，并吸引AL靠近HL和瘤灶，F(xiàn)G可防止HL和AL在注射部位堆積壞死。由于HL受到FG保護和限制，且FG-HL被注射在血管外；故HL不易被受者免疫清除，HL對受者組織的免疫損傷也主要局限在注射部位。這種血管外接種外來抗原是目前通行的免疫接種法，要比血管內(nèi)接種的免疫效果更好。

本文療法分前后兩階段，前階段用FG-HL激活受者AL免疫反應；后階段采集被激活的AL組成FG-AL回輸?shù)阶泽w(或同基因小鼠)荷瘤組織表面抗腫瘤。為了減少HL對受者的損害(GVHE)并保持受者的免疫敏感性，這兩個階段應交替序貫進行，使HL間歇出現(xiàn)在受者體內(nèi)，不斷激活AL以產(chǎn)生持久的抗腫瘤免疫力。本文所用供、受鼠的主要組織相容性復合物(MHC或H-2)為半相合，使HL較易在受鼠體內(nèi)存活。這與臨床上親人間移植較接近。同理，Hepa 1-6瘤細胞接種在半相合的CB6F1受鼠身上較易成瘤。市售的纖維蛋白膠已用于臨床修復傷口、止血等，濃度小于5 g/L時也可作細胞培養(yǎng)基質(zhì)骨架[10]。注入體內(nèi)的纖維蛋白膠一般在14 d左右被降解[11]。淋巴細胞可遷移穿過組織、腹膜[12]，故AL可匯集到HL和腫瘤周圍，發(fā)揮免疫清除和抗腫瘤作用。本文用濃縮人血漿自制纖維蛋白膠代替市售的動物纖維蛋白膠，是為了將來用于人體時避免產(chǎn)生異種蛋白反應。加入的胰蛋白酶可選擇性降解變性的蛋白(如FG凝膠)并清除，有利于混合淋巴細胞反應和下一輪注射。月桂氮卓酮是一種透皮促進劑，可增加細胞間和腹膜通透性，便于淋巴細胞穿過。也可將膠原溶液注射到組織腔隙形成凝膠狀人工囊腔，引導將HL經(jīng)皮多次注入人工囊腔，移植到特定部位[13]。

綜上所述，本方法要點是將FG-HL注射到受者體內(nèi)荷瘤組織表面，可局限HL對受者的免疫損害，并用FG-HL募集、激活受者AL，再采集受者被激活的AL組成FG-AL回輸?shù)胶闪鼋M織表面。序貫反復施行本法，可將HL多次用于受者，不斷激活AL，并使AL集中在腫瘤局部發(fā)揮大體靶向抗瘤作用。