circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究進(jìn)展△

霍佳寧，馬曉欣

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004

自非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）成為研究熱點以來，其對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要性逐漸被認(rèn)識。繼微小RNA（microRNA，miRNA）與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）之后，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）成為新的研究熱點。circRNA是一類特殊的ncRNA，其最早在仙臺病毒中被發(fā)現(xiàn)，它區(qū)別于傳統(tǒng)的線性RNA，是一類新型的RNA，具有特殊的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此，circRNA不易降解，在多種生物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，更適合作為腫瘤診斷與治療的靶點[1-2]。miRNA是在多種真核細(xì)胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性lncRNA，長度為22～28 nt，在進(jìn)化方面具有保守性。miRNA在多種腫瘤中以癌基因或抑癌基因的方式發(fā)揮作用，因而與腫瘤的關(guān)系十分密切[3]。越來越多的研究表明，circRNA可以與miRNA結(jié)合影響腫瘤的生物學(xué)行為，針對circRNA-miRNA軸的研究正在被不斷豐富，本文旨在綜述circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究進(jìn)展及其對腫瘤診斷與治療的可能應(yīng)用。

1 circRNA的形成及其功能

circRNA根據(jù)序列的形成和組合方式的不同分為3種類型：外顯子來源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內(nèi)含子來源的circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）、外顯子-內(nèi)含子 circRNA（exonic-intronic circRNA，EIciRNA）。目前發(fā)現(xiàn)的80%的circRNA為ecircRNA，ecircRNA的形成機(jī)制主要通過兩種途徑：套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化。ciRNA主要通過自我剪接內(nèi)含子形成。EIciRNA的形成機(jī)制目前尚未研究清楚。

目前發(fā)現(xiàn)的circRNA的功能主要包括以下幾個方面：①作為miRNA海綿競爭性結(jié)合miRNA的結(jié)合位點，使miRNA失去其自身功能及對下游靶基因的調(diào)節(jié)功能。②調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，EIciRNA通過與基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游300 bp的RNA聚合酶Ⅱ相互作用來增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄功能和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；同時，拼接因子MBL的第2個外顯子可以環(huán)化形成circRNA，影響線性RNA的形成，以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。③與蛋白質(zhì)相互作用，miRNA效應(yīng)器Argonaute（AGO）可以通過與circRNA等結(jié)合而降解。同時，circRNA通過與蛋白質(zhì)相互作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程。④參與蛋白質(zhì)翻譯，大多數(shù)circRNA為ecircRNA，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，因此，可以裝載至核糖體中，并翻譯成多肽。

2 miRNA的海綿作用

一些具有相同miRNA應(yīng)答元件的RNA可以競爭性結(jié)合miRNA位點來影響miRNA對其靶基因的作用，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為，稱為miRNA的“海綿作用”（miRNA sponge）。目前有研究表明，circRNA也能夠競爭性結(jié)合miRNA位點，影響miRNA及下游靶基因的表達(dá)。circRNA通過應(yīng)答元件與miRNA相互關(guān)聯(lián)后，既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為一種原癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[4]。小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一種miRNA的拮抗劑，作為微小 RNA-7（microRNA-7，miRNA-7）海綿影響miRNA-7靶基因的活性[5]。此外，miRNA-671可與CDR1as完全互補(bǔ)并引起其降解[6]。

3 circRNA-miRNA軸在腫瘤中的研究

3.1 circRNA-miRNA軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究

Zheng等[7]研究表明，環(huán)狀τ-微管蛋白激酶2（tau tubulin kinase 2，TTBK2）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，而線性TTBK2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中并無差異性表達(dá)。環(huán)狀TTBK2的高表達(dá)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡。環(huán)狀TTBK2可以作為miRNA-217海綿抑制miRNA-217的表達(dá)，從而影響下游靶基因肝細(xì)胞核因子 1β（hepatocyte nuclear factor 1 beta，HNF1β）的表達(dá)以及膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。

3.2 circRNA-miRNA軸在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的研究

研究表明，在45例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的組織中和5例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的細(xì)胞系中，miRNA-671-5p呈現(xiàn)過表達(dá)，并且影響了多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移，在較小程度上影響了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。此研究利用生物信息學(xué)預(yù)測確定CDR1as、CDR1、VSNL1為miRNA-671-5p的靶基因，它們在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)均下調(diào)，且與miRNA-671-5p有關(guān)，故認(rèn)為miRNA-671-5p/CDR1as/CDR1/VSNL1軸可以影響多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]。

3.3 circRNA-miRNA軸在肝細(xì)胞癌中的研究

在肝細(xì)胞癌中，hsa_circ_0005986的表達(dá)下調(diào)，其可以作為miRNA-129-5p的海綿，使miRNA-129-5p得到釋放，進(jìn)而使下游靶基因Notch1的表達(dá)下調(diào)，加速肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變[9]。Huang等[10]利用circRNA芯片檢測出226個在肝細(xì)胞癌組織中差異性表達(dá)的circRNA，其中，189個circRNA的表達(dá)上調(diào)，37個circRNA的表達(dá)下調(diào)。circRNA-100338是上調(diào)的circRNA之一，作為內(nèi)源性海綿與miRNA-143-3p結(jié)合從而影響肝癌細(xì)胞的侵襲。該研究認(rèn)為，circRNA-100338是對肝細(xì)胞癌的診斷和治療具有潛在價值的標(biāo)志物。Xu等[5]研究證實，ciRS-7（CDR1as）在并發(fā)微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）的組織中的表達(dá)與miRNA-7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，ciRS-7可以作為肝MVI的生物標(biāo)志物和MVI治療的靶向標(biāo)志。circMTO1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，circMTO1作為致癌基因miRNA-9的海綿來影響p21的表達(dá)。有研究認(rèn)為，circ-MTO1是肝細(xì)胞癌治療的潛在靶點，肝細(xì)胞癌組織中circMTO1表達(dá)的下降可以作為預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)[11]。Shang等[12]采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗證肝細(xì)胞癌組織中3個circRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005075的表達(dá)差異最明顯，且相對表達(dá)量與肝細(xì)胞癌的腫瘤大小有關(guān)，并構(gòu)建了以hsa_circ_0005075為中心的circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，包括 miRNA-23b-5p、miRNA-93-3p、miRNA-581、miRNA-23a-5p，其關(guān)系有待進(jìn)一步研究證實。研究表明，與正常肝組織相比，CDR1as在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)上調(diào)，miRNA-7在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)下調(diào)。此外，敲除CDR1as、過表達(dá)miRNA-7可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。miRNA-7過表達(dá)可以抑制其下游靶基因CCNE1和PIK3CD的表達(dá)，敲除CDR1as可以抑制miRNA-7的表達(dá)，也可以抑制CCNE1和PIK3CD基因的表達(dá)[13]。

3.4 circRNA-miRNA軸在骨肉瘤中的研究

有研究表明，circUBAP2在人骨肉瘤組織中的表達(dá)有所增加，與骨肉瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，表達(dá)上調(diào)的circUBAP2可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長并抑制其凋亡。circUBAP2通過抑制miRNA-143的表達(dá)，影響抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)[14]。

3.5 circRNA-miRNA軸在胃癌中的研究

circRNA_100269在胃癌組織中的表達(dá)水平降低，雙熒光素酶實驗證實circRNA_100269與miRNA-630靶向結(jié)合，且miRNA-630在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與circRNA_100269呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)circRNA_100269抑制了miRNA-630的表達(dá)，同時抑制了胃癌細(xì)胞的增殖[15]。miRNA-7過表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，并且這種抑制作用可以被作為miRNA-7海綿的ciRS-7的過表達(dá)所中和，且二者的相互作用進(jìn)一步影響人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源/磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten/phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PTEN/PI3K/AKT）通路[16]。

3.6 circRNA-miRNA軸在乳腺癌中的研究

Liang等[17]通過circRNA芯片篩選出乳腺癌組織中差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)circ-ACBC10在乳腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，沉默circ-ACBC10可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。通過生物信息學(xué)預(yù)測與熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，circ-ACBC10與miRNA-1271靶向結(jié)合，并且circ-ACBC10作為miRNA-1271海綿影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

3.7 circRNA-miRNA軸在肺癌中的研究

有研究證實，cir-ITCH作為miRNA-7與miRNA-214的海綿通過增強(qiáng)其親本基因ITCH的表達(dá)抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制肺癌的進(jìn)展[18]。Tian等[19]在前期研究中證實，肉桂醛（cinnamaldehyde，CA）可以誘導(dǎo)3種非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞發(fā)生凋亡，然后通過芯片及熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0043256的表達(dá)在CA處理的NSCLC細(xì)胞中上調(diào)，其可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。通過生物信息學(xué)預(yù)測并應(yīng)用熒光素酶實驗驗證，hsa_circ_0043256作為miRNA-1252海綿，可調(diào)節(jié)親本基因ITCH的表達(dá)并影響Wnt/β-catenin信號通路。hsa_circ_0043256/miRNA-1252/ITCH軸介導(dǎo)的新機(jī)制為肺癌的治療提供了新的方向。

3.8 circRNA-miRNA軸在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究

Li等[20]利用PCR實驗分析了來自中國東部和南部共684例食管鱗癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織與相應(yīng)癌旁組織中cir-ITCH的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，cir-ITCH在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平較低。cir-ITCH發(fā)揮海綿作用與miRNA-7、miRNA-17、miRNA-214 結(jié)合，使 ITCH的表達(dá)上調(diào)，使磷酸化Dvl2發(fā)生泛素化并降解，進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin信號通路。

3.9 circRNA-miRNA軸在結(jié)直腸癌中的研究

在結(jié)直腸癌中，circ-001569與miRNA-145的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miRNA-145與E2F5的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，BAG4與FMNL2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過circ-001569-miRNA-145-E2F5/BAG4/FMNL2 軸影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[21]。Zhang等[22]采用定量PCR檢測has_circ_0020397和miRNA-138在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)has_circ_0020397的表達(dá)上調(diào)，miRNA-138的表達(dá)下調(diào)，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在證實二者存在差異性表達(dá)且表達(dá)具有相關(guān)性后，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了二者的靶向結(jié)合與結(jié)合位點。has_circ_0020397可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲，并抑制其凋亡，而miRNA-138具有相反的作用。

3.10 circRNA-miRNA軸在膀胱癌中的研究

Huang等[23]利用芯片檢測4例膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA、circRNA和信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表達(dá)圖譜，檢測出數(shù)千個顯著改變的lncRNA和mRNA以及數(shù)百個circRNA。5個lncRNA和4個mRNA通過實時熒光定量PCR在30例患者的癌組織與癌旁組織中得到證實，circRNA-MYLK作為miRNA-29a-3p海綿使靶基因DNMT3B、VEGFA和ITGB1的表達(dá)上調(diào)。Zhong等[24]通過circRNA芯片篩選出在膀胱癌組織中差異表達(dá)的circRNA，并采用定量PCR驗證，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測可能與之結(jié)合的miRNA，隨后證實circTCF25的過表達(dá)可以下調(diào)miRNA-103a-3p和miRNA-107的表達(dá)，上調(diào)CDK6的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖、轉(zhuǎn)移，因此，circTCF25可能成為膀胱癌新的標(biāo)志物。

3.11 circRNA-miRNA軸在基底細(xì)胞癌中的研究

Sand等[25]在基底細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了71個差異表達(dá)的circRNA，且circRNA與miRNA有結(jié)合位點，提示circRNA-miRNA軸在基底細(xì)胞癌中也發(fā)揮作用。

3.12 circRNA-miRNA軸在婦科腫瘤中的研究

CDR1as與環(huán)形的睪丸特異性RNA分子SRY是兩個經(jīng)典的circRNA，它們含有miRNA-7和miRNA-138結(jié)合元件，且miRNA-7和miRNA-138在卵巢癌和宮頸癌中發(fā)揮抑制作用[26-27]。

3.13 其他

Zheng等[28]通過測序篩選出在6種正常組織（腦、結(jié)腸、心臟、肝、肺和胃）和7種腫瘤（膀胱尿路上皮細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、腎細(xì)胞癌和前列腺癌）組織中存在差異性表達(dá)的circRNA——circHIPK3。進(jìn)而通過熒光素酶實驗得出circHIPK3直接結(jié)合miRNA-124并抑制miRNA-124的活性的結(jié)論。

4 小結(jié)與展望

如今，惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因此，尋找到早期診斷腫瘤的標(biāo)志物以及有效的治療靶點顯得尤為重要。circRNA早在20世紀(jì)就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是都認(rèn)為它是一種拼接錯誤，并未引起重視，近幾年來，證實其廣泛存在于生物體內(nèi)，使人們對真核生物轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識更加深刻。circRNA在生物體內(nèi)的作用越來越受到人們的重視，尤其在腫瘤方面，circRNA成為繼miRNA、lncRNA后新的研究熱點。但是，這個領(lǐng)域依然存在很多問題，例如逆轉(zhuǎn)錄過程中的模板轉(zhuǎn)換和滾環(huán)擴(kuò)增、缺乏命名circRNA的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等。同時可以看出，除了對CDR1as-miRNA-7和cir-ITCH-miRNA7/214這兩種circRNA-miRNA軸的研究較多外，對其他circRNA-miRNA軸的研究均相對較少[29-30]。從疾病方面可以看到，circRNA-miRNA軸在肝細(xì)胞癌中的研究較多，在其他惡性腫瘤中的研究較少，在婦科腫瘤中更是少有研究。同時，對circRNA-miRNA軸的形成機(jī)制、功能及其在腫瘤中作用的研究還不夠深入。研究者應(yīng)該借鑒miRNA與lncRNA的研究思路，建立全面的、不斷更新的circRNA數(shù)據(jù)庫并形成circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，將幾種ncRNA的研究聯(lián)系在一起。更多的circRNA需要被發(fā)現(xiàn)，而它的保守性、穩(wěn)定性及組織特異性的特點使它有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點，為臨床的診斷和治療提供新的視角和新的方向，也為明確circRNA-miRNA軸在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用、機(jī)制以及為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的思路。