HPLC測定混合型飼料添加劑中L-蘋果酸含量

■楊建平 陳鮮鑫 劉 星

（1.四川美嘉龍生物科技有限公司，四川樂山614000；2.樂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川樂山614000；3.四川省樂山市農(nóng)業(yè)局，四川樂山614000）

L-蘋果酸（L-malic acid，簡稱LMA)是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)的成員之一[1-2],也是一種重要的有機酸，在化工、食品、醫(yī)藥、畜牧等行業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途[3]。在食品領(lǐng)域，L-蘋果酸已成為繼檸檬酸、乳酸之后，用量排第三位的食品酸味劑，同時L-蘋果酸還可用于食品保鮮和除臭[4]。在醫(yī)藥行業(yè)中，L-蘋果酸直接參與人體新陳代謝，具有抗疲勞、保護(hù)肝臟、腎臟、心臟的作用以及降低抗癌藥物的毒副作用等[5-6]。它作為酸化劑和病原微生物的抑制劑已用于反芻動物。對動物的生理和營養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在以下五方面：①改善胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系，抑制有害菌生長，促進(jìn)有益菌增殖；②調(diào)節(jié)胃中pH值和減緩胃的排空速度，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收；③直接參與體內(nèi)代謝，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率；④改善飼料適口性，增強食欲；⑤抗應(yīng)激[7]和改善睡眠[8]。因此在動物飼料使用過程中替代胃酸，抑制病原微生物，減少抗生素使用，提高斷奶仔豬的日增重有很好效果。目前L-蘋果酸的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為化學(xué)滴定法，該方法干擾多、誤差大。本文采用高效液相色譜法測定混合型飼料添加劑中L-蘋果酸含量，以此來解決在分析過程中干擾多、誤差大、準(zhǔn)確性低的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

磷酸二氫鉀：分析純，成都科龍化工試劑廠，含量≥99.5%；磷酸：分析純，成都科龍化工試劑廠，含量≥85.0%；乙腈：色譜純，成都諾爾施化工試劑公司，含量≥99.9%；L-蘋果酸對照品：中國食品藥品檢定研究院，含量≥99.0%。聚四氟乙烯膜濾紙，天津津騰。高效液相色譜儀[包括：紫外-可見光檢測器(UV230Ⅱ)，色譜柱C18（250 mm×4.6 mm×5 μm推薦改性柱），EC2006色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，自動進(jìn)樣器]，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm×5 μm改性柱）；流動相：0.02 mol/l磷酸二氫鉀∶乙腈=98∶2（v∶v），用磷酸來調(diào)pH值2.3±0.05；柱溫：25℃；檢測波長為210 nm；流速：0.8 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

1.2.2 檢測方法

通過色譜柱使樣品溶液中各組分分離，用紫外吸收檢測器檢測，用外標(biāo)法定量，計算樣品(混合型飼料添加劑蘋果酸)中L-蘋果酸的含量。

1.2.3 溶液的配制

1.2.3.1 0.02 mol/l磷酸二氫鉀溶液的配制

稱取磷酸二氫鉀2.7 g加水溶解，并稀釋至1 000 ml。

1.2.3.2 流動相的配制

0.02 mol/l磷酸二氫鉀∶乙腈=98∶2（v∶v），用磷酸調(diào)pH值2.3±0.05，再經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯膜濾膜過濾，即得。

1.2.3.3 對照品溶液的配制

精密稱取蘋果酸對照品10.0 mg左右（精確至0.000 02 g)至10 ml容量瓶中加入流動相5 ml，超聲15 min，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（每1 ml溶液約含蘋果酸對照品1 mg）。

1.2.3.4 供試品溶液制備

取混合型飼料添加劑蘋果酸樣品3批次，精密稱取樣品125.0 mg左右（精確至0.000 02 g)至25 ml容量瓶中，再移取10 ml的流動相加入容量瓶中，超聲15 min，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液作供試品溶液。

1.2.4 樣品檢測

按高效液相色譜操作規(guī)程開機，調(diào)節(jié)溫度及流量，達(dá)到分析條件并基線平穩(wěn)后，分別精密量?。ɑ蜃詣舆M(jìn)樣）供試品溶液和對照品溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算含量，即得。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將濃度為2 020、1 010、505、252.5、126.25 μg/ml的對照品溶液分別吸取10 μl注入HPLC，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 精密度的測定

精密吸取蘋果酸對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算對照品峰面積積分值的RSD。

1.2.7 重復(fù)性的測定

分別稱取同批蘋果酸樣品6份，采用高效液相色譜法測定蘋果酸含量，并計算樣品的RSD值。

1.2.8 回收率的測定

用加樣回收試驗，取已知含量的同一批供試品各9份，精密稱定，分別精密添加一定量的蘋果酸對照品，按供試品制備所述方法測定含量(同時測定樣品含量)，計算回收率。

1.2.9 含量測定

取樣品3批，按供試品制備方法制備樣品，測定樣品蘋果酸的含量。

1.2.10 蘋果酸含量計算

式中：w——蘋果酸含量(%)；

CR——對照品的濃度(mg/ml)；

AX——樣品的峰面積；

AR——對照品的峰面積；

V——樣品溶液總體積(ml)；

n——樣品稀釋倍數(shù)；

m——試樣的質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酸對照品和樣品的HPLC的色譜圖（見圖1、圖2）

本實驗條件下，樣品處理簡單省時，由色譜圖1和圖2中可見蘋果酸對照品保留時間在3.9 min左右，而樣品在3.9 min左右處也出現(xiàn)一個較好的峰形，并且基線平穩(wěn)，說明此方法可行。

圖1 蘋果酸對照品HPLC色譜圖

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測出的峰面積結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗所得回歸方程為Y=0.390 9X-4.578 6，R=0.999 8(n=5)。試驗表明，蘋果酸對照品在126.25～2 020 μg/ml的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，最低檢測量為12.23 μg/ml。

2.3 精密度

精密取蘋果酸對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次。測得5次蘋果酸的峰面積分別為800.71、795.73、796.71、794.83、791.34，峰面積平均值為 795.74±3.39，RSD=0.43%(n=5)，說明本法精密度良好。

表1 精密度結(jié)果

2.4 重復(fù)性

分別取同批蘋果酸樣品6份，采用高效液相色譜法測定，結(jié)果見表2。

表2結(jié)果顯示，測得6份蘋果酸樣品的含量分別為98.89%，99.06%、99.38%、99.15%、98.96%和99.11%，含量平均值（99.09±0.001 7）%。RSD=0.17%(n=6)，說明本法重復(fù)性良好。

2.5 回收率

表2 6份蘋果酸樣品測定結(jié)果

用加樣回收試驗，取已知含量的同一批供試品各9份，回收率測定結(jié)果見表3。從表3可看出，回收率為(98.35±0.006)%，RSD=0.61%。

上述樣品的精密度實驗結(jié)果中蘋果酸對照品峰面積積分值RSD為0.43%，表明此方法精密度較好；重復(fù)性結(jié)果蘋果酸樣品的RSD為0.17%，表明重復(fù)性良好；回收率實驗結(jié)果顯示回收率達(dá)到98.35%，RSD為0.61%。充分表明檢測方法良好，適合其樣品的檢測。

表3 回收率測定結(jié)果

2.6 樣品含量測定（見表4）

表4 樣品含量結(jié)果（n=3）

由表4看出，本樣品的蘋果酸平均含量為（99.01±0.11）%，符合產(chǎn)品規(guī)定的質(zhì)量要求。

3 討論

L-蘋果酸作為酸化劑和病原微生物抑制劑，具有酸味柔和、爽快、刺激性緩慢、保留時間長的特點，是一種優(yōu)良的食品添加劑[9],已應(yīng)用于反芻動物。同時L-蘋果酸是瘤胃微生物代謝途徑的中間產(chǎn)物，可被微生物或其他生化反應(yīng)代謝利用，無殘留，不存在微生物的耐藥性、病原體抗藥性轉(zhuǎn)移和藥物殘留等問題，可更好的更有效的預(yù)防和控制反芻動物在飼喂過程中發(fā)生的瘤胃酸中毒[10]。在食品添加劑中對其檢測尤其重要。由于L-蘋果酸沒有紫外或熒光吸收，很難直接檢測，需經(jīng)酸解成蘋果酸單體后通過計算蘋果酸的增加量來計算。目前常用的蘋果酸檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、酶試劑盒法、紙層析法、α-2，7-萘二酚法等[11]。以該方法測定其含量，相對其他含量測定方法更加具體和明確，質(zhì)量控制方法更加科學(xué)[12]，可為混合飼料中測定L-蘋果酸提供一定的依據(jù)。

4 結(jié)語

L-蘋果酸對照品和樣品的保留時間均是3.9 min，其線性方程為Y=0.390 9X-4.578 6，R=0.999 8(n=5)，在126.25～2 020 g/ml的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其最低檢測量12.23 g/ml。精密度的RSD為0.43%，表明此方法精密度較好；重現(xiàn)性的RSD為0.17%，表明重現(xiàn)性良好；回收率的RSD為0.61%。用此方法檢測出其混合飼料添加劑中L-蘋果酸含量為(99.01±0.11)%，符合產(chǎn)品規(guī)定的質(zhì)量要求。該實驗建立的HPLC檢測方法可以使混合飼料中L-蘋果酸的測定快速、準(zhǔn)確，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。