■侍寶路 王計(jì)偉劉春雪 孫海林 王二柱 胡丹丹
(安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司,江蘇太倉(cāng)215437)
在我國(guó)豆渣是一種常見(jiàn)的食品副產(chǎn)物,其水分高(80%左右),產(chǎn)量大(2 000萬(wàn)噸/年)[1]。豆渣中富含膳食纖維、微量元素、維生素B1等,是良好的飼料原料[2]。但未經(jīng)處理的新鮮豆渣適口性差,不易貯存,除少部分作為飼料使用外,大部分豆渣被直接丟棄造成環(huán)境污染[3]。通過(guò)微生物發(fā)酵的方式有效改善新鮮豆渣的適口性,提高其貯藏性能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,在畜禽養(yǎng)殖中具有現(xiàn)實(shí)意義。
有學(xué)者通過(guò)利用霉菌和酵母菌發(fā)酵分解豆渣中的纖維素等多糖生產(chǎn)蛋白飼料[4-6]。辜瀾濤等使用乳酸菌、酵母菌和枯草桿菌復(fù)合菌劑發(fā)酵豆渣,粗蛋白含量由發(fā)酵前的19.76%提高為28.06%[7]。張永根等向豆渣中添加乳酸菌和枯草芽孢桿菌,通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件,將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓袡C(jī)酸、耐貯存的反芻飼料[8]。張文佳等通過(guò)白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵豆渣,改善其適口性并提高了貯存性能[9]。
酸化飼料通常是在飼料中添加酸化劑,降低飼料的pH值,在達(dá)到防霉效果的同時(shí)可以提高飼養(yǎng)效益[10],提高豬尤其是幼齡仔豬的腸道健康[11]。豆渣中含有較高的纖維素,限制了適口性和使用量,關(guān)于通過(guò)發(fā)酵降解豆渣中中性洗滌纖維(NDF)并提高其酸度的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)以豆渣為原料,添加麩皮為輔料,利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵改善其適口性并降低物料的pH值,降低NDF含量,將其變成耐貯存、適口性強(qiáng)的酸化飼料,用于提高動(dòng)物腸道健康。
1.1.1 試驗(yàn)材料
原料:豆渣(來(lái)自于江蘇省太倉(cāng)市彬彬豆業(yè)食品有限公司)。
輔料:麩皮(購(gòu)于江蘇省太倉(cāng)市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))。
1.1.2 試驗(yàn)菌種
乳酸菌:安佑研究院微生物研究所菌種庫(kù)乳酸菌5株(編號(hào):X-1、X-2、X-3、X-4、X-5),具有甘油管和固體菌粉制劑兩種形式,5種固體菌粉制劑為經(jīng)生產(chǎn)調(diào)配后濃度相同,且活菌數(shù)均大于1×109cfu/g。
釀酒酵母:來(lái)自安佑研究院微生物研究所,菌粉活菌數(shù)大于1×108cfu/g。
1.1.3 培養(yǎng)基
固體培養(yǎng)基:濕豆渣與麩皮按7∶3比例混合后水分約為60%的發(fā)酵物料。
MRS液體培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基:購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.2.1 高產(chǎn)酸乳酸菌株篩選
將5株乳酸菌甘油管接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8~10 h,活菌數(shù)達(dá)到大于109cfu/ml為止。
1.2.1.1 初篩
① 溶鈣圈法:將活化好的菌液接種于100 ml MRS液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h;使用牛津杯法測(cè)量溶鈣圈直徑大小,牛津杯中加入250 μl菌液[12],每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。
②酸堿滴定法[12]:
將活化好的菌液接種于100 ml MRS液體培養(yǎng)基中,恒溫靜置培養(yǎng)48 h,取1 ml發(fā)酵液稀釋消除底色干擾,以1%酚酞作指示劑,用0.1 mol/l的NaOH溶液滴定至為微紅色,每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。酸度以100 ml發(fā)酵液消耗的NaOH的摩爾數(shù)來(lái)表示:
式中:CNaOH——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(0.1 mol/l);VNaOH——滴定所用的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(L)。篩選出鈣溶圈較大且酸度較強(qiáng)的3株乳酸菌進(jìn)入復(fù)篩。
1.2.1.2 復(fù)篩
進(jìn)入復(fù)篩的乳酸菌菌種,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝調(diào)配后濃度相同,且活菌數(shù)均大于1×109cfu/g。取一定量固體培養(yǎng)基,分別接種進(jìn)入復(fù)篩的乳酸菌菌粉制劑,接種量均為2‰,混勻后裝進(jìn)發(fā)酵袋中,排出空氣將袋口扎緊,模擬養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)酵密封條件,36℃發(fā)酵72 h,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),測(cè)定發(fā)酵后物料中總酸含量,來(lái)確定產(chǎn)總酸最多的1株乳酸菌。
1.2.2 乳酸菌與酵母菌混合比例的確定
1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳發(fā)酵條件組合
采用乳酸菌和釀酒酵母菌在上述試驗(yàn)中得到的最佳配方比例,選擇接種量(A)、含水量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為考察因素,每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平,以發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)和pH值作為綜合考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。
表1 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)
1.2.4 最佳發(fā)酵條件下物料的營(yíng)養(yǎng)成分在發(fā)酵前后的變化
通過(guò)單因素篩選試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到的最佳發(fā)酵條件,在此條件下得到發(fā)酵產(chǎn)物,在物料質(zhì)地、pH值、總酸、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量等方面比較發(fā)酵前后的變化。
1.3.1 飼料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定
飼料中的水分、總酸和粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—1994和GB/T 12456—2008方法;中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)參照Van Soest等[13]方法進(jìn)行測(cè)定;pH值采用PHS-3C型酸度計(jì)直接測(cè)定。
1.3.2 活菌數(shù)的測(cè)定
牙周-牙髓聯(lián)合病變涉及牙周、牙髓及根尖周組織,三者互相影響且可呈現(xiàn)多種臨床表現(xiàn),其中Ⅰ型牙周-牙髓聯(lián)合病變主要是由牙髓及根尖周病引起的牙周病變[1-2]。若牙周-牙髓聯(lián)合病變病程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),則易導(dǎo)致牙槽骨缺損;經(jīng)完善的根管治療及牙周治療后,牙周病變可得到明顯改善,而牙周組織的破壞能否較好的修復(fù)則有待觀察[3]。近年來(lái),再生性牙周手術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越普遍,主要包括引導(dǎo)性組織再生術(shù)(Guided tissue regeneration, GTR)及植骨術(shù)[4]。本研究對(duì)Ⅰ型牙周-牙髓聯(lián)合病變患牙進(jìn)行GTR聯(lián)合骨移植術(shù),以探討其對(duì)牙周組織病變修復(fù)治療的有效性。
乳酸菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)測(cè)定分別參照GB 4789.35-2016和GB 4789.15-2016方法。
1.3.3 乳酸菌與酵母菌混合比例的確定
以本試驗(yàn)總酸和ΔNDF含量(NDF降解量)為考察指標(biāo),予不同的權(quán)重系數(shù),總酸和ΔNDF含量分別為0.5和0.5,再進(jìn)行加權(quán)評(píng)分,綜合評(píng)分(OD)=0.5A/Amax+0.5B/Bmax,(A為總酸含量,B為ΔNDF含量)。
發(fā)酵原料為新鮮豆渣與麩皮按7∶3比例混合,其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分如表2所示。
表2 發(fā)酵原料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)
對(duì)5株乳酸菌進(jìn)行溶鈣圈試驗(yàn),牛津杯中發(fā)酵菌液含有的有機(jī)酸和培養(yǎng)過(guò)程中乳酸菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸,滲透到含有1%CaCO3培養(yǎng)基中,形成透明圈。在充足的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量不同,形成的溶鈣圈大小不同。溶鈣圈測(cè)量結(jié)果如表3所示。
表3 溶鈣圈測(cè)量結(jié)果
采用酸堿滴定法測(cè)定5株乳酸菌的發(fā)酵酸度,結(jié)果見(jiàn)圖1。菌株X-1、X-2和X-3的發(fā)酵酸度較高,且驗(yàn)證了溶鈣圈法結(jié)果,因此進(jìn)入復(fù)篩的3株乳酸菌為:X-1>X-2>X-3。
圖1 各菌株產(chǎn)酸量
由表4可以看出,以新鮮豆渣為原料,麩皮為輔料,接種進(jìn)入復(fù)篩的乳酸菌,恒溫厭氧發(fā)酵后,菌株X-2發(fā)酵產(chǎn)生總酸最多,因此菌株X-2為本試驗(yàn)產(chǎn)酸量高的乳酸菌株,為植物乳桿菌。
表4 3株乳酸菌發(fā)酵豆渣中總酸含量(絕干基計(jì))
表5 兩種菌株以不同比例發(fā)酵后綜合評(píng)分
由表5可以看出,混合比例為50∶50時(shí)綜合評(píng)分OD最高,能夠有效降解物料中NDF的同時(shí)產(chǎn)生更多的有機(jī)酸。
選定植物乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合比例為50∶50,按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平試驗(yàn),測(cè)定各因素水平下活菌數(shù)和pH值,其結(jié)果見(jiàn)表6。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出最佳的試驗(yàn)組合為A1B3C3D3,即最佳工藝條件:接種量為2‰,發(fā)酵原料含水量為70%,發(fā)酵溫度為36℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h。
表6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
由表7可知,物料經(jīng)發(fā)酵后由原來(lái)的豆腥味變?yōu)榘l(fā)酵酸香氣味,NDF含量由49.65%降為36.09%,總酸含量由1.19%增加為3.45%,發(fā)酵后物料pH值由6.44降為3.75,適口性大大提高,酸性條件下有利于儲(chǔ)存。
表7 發(fā)酵前后部分營(yíng)養(yǎng)參數(shù)的比較
由于新鮮豆渣濕度較大,若暴露在空氣中,易造成霉菌和一些好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,其溫度及pH值隨之升高,新鮮豆渣開(kāi)始腐敗,影響豆渣的保質(zhì)期[14]。而在新鮮豆渣中接種乳酸菌,通過(guò)密閉厭氧發(fā)酵,迅速生長(zhǎng)繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群,同時(shí)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸,降低物料的pH值,抑制腐敗微生物菌群的生長(zhǎng)繁殖,達(dá)到保鮮的目的[15]。有研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸通過(guò)改變致病菌細(xì)胞膜電位達(dá)到抑菌的效果[16];同時(shí)改變有害微生物生存環(huán)境的pH值,抑制其生長(zhǎng)繁殖[17]。因此,為了延長(zhǎng)發(fā)酵豆渣的保質(zhì)期,應(yīng)篩選出產(chǎn)酸量高的乳酸菌。由試驗(yàn)結(jié)果比較5株乳酸菌的產(chǎn)酸能力,以豆渣為發(fā)酵基質(zhì)時(shí),植物乳桿菌為高產(chǎn)酸乳酸菌株。
為了模擬養(yǎng)殖場(chǎng)的厭氧發(fā)酵條件,將發(fā)酵袋排除空氣后扎緊袋口,未經(jīng)抽真空處理,故在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵袋并非嚴(yán)格厭氧。植物乳桿菌為耐氧性厭氧菌,微氧環(huán)境并不影響它的生長(zhǎng)繁殖[18]。酵母菌有氧條件下代謝產(chǎn)生風(fēng)味有機(jī)酸[19]和厭氧條件下產(chǎn)生乙醇,均可改善豆渣的風(fēng)味。酵母菌擁有豐富的酶系統(tǒng),能夠產(chǎn)生淀粉酶、內(nèi)生葡聚糖酶、內(nèi)生糖苷酶、木聚糖酶等。通過(guò)兩種菌株的混合發(fā)酵降低豆渣中的NDF含量,一方面降低物料的pH值,延長(zhǎng)保質(zhì)期;另一方面發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸、乙醇及一些風(fēng)味物質(zhì)明顯改善豆渣的適口性,而纖維含量與適口性有很大關(guān)系,常用NDF含量來(lái)表示[20]。綜合評(píng)價(jià)是根據(jù)多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的重要性,確定每項(xiàng)所占的權(quán)重,將多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果化為單項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果,以求得其優(yōu)劣等級(jí)的一種評(píng)價(jià)方法[21]。試驗(yàn)通過(guò)發(fā)酵后豆渣的NDF降解量和總酸含量的綜合評(píng)分(OD)來(lái)確定最佳的發(fā)酵比例。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,乳酸菌與酵母菌混合最佳比例為50∶50。
對(duì)于混菌發(fā)酵技術(shù)而言,接種量、含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度等因素相互影響,對(duì)發(fā)酵效果有重要影響。接種量的大小影響著發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)繁殖速度,加大接種量可以使發(fā)酵菌短時(shí)間內(nèi)成為優(yōu)勢(shì)菌群,減少雜菌污染,提高發(fā)酵效果。考慮實(shí)際生產(chǎn)成本,為使發(fā)酵效益最大化,選擇最合適的接種量是發(fā)酵的關(guān)鍵。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,選取A1為該因素的最佳水平,即最適宜的接種量為2‰。
提高物料的起始含水量,可增加水解酶的產(chǎn)生并促進(jìn)其擴(kuò)散;同時(shí)提高物料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和減少代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵菌種的抑制作用,有助于發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)代謝[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果中顯示B3為該因素最佳水平,即發(fā)酵原料最佳含水量為70%,與前人研究結(jié)果相符。
發(fā)酵溫度影響微生物生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶活,影響代謝產(chǎn)物的形成和發(fā)酵效果[24],所以要嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度。試驗(yàn)所用釀酒酵母與乳酸菌的最適培養(yǎng)溫度不同,由試驗(yàn)結(jié)果看出,C3為該因素最佳水平,即發(fā)酵溫度為36℃。
發(fā)酵時(shí)間是確定發(fā)酵是否可結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短,會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵底物未被充分利用,未到達(dá)預(yù)期效果,發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致物料損耗過(guò)多,發(fā)酵成本增加,并增加了發(fā)酵物料染菌幾率。本試驗(yàn)結(jié)果選取D3為該因素的最佳水平,即最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。
通過(guò)正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵豆渣,產(chǎn)物由原來(lái)的豆腥味變?yōu)榘l(fā)酵酸香味,且后期隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),釀酒酵母持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的酒香氣味更加濃郁。豆渣經(jīng)發(fā)酵后,NDF含量下降了27%,總酸含量提高了1.9倍,pH值降為3.75。發(fā)酵的酸性條件有利于抑制雜菌生長(zhǎng),延長(zhǎng)貯存時(shí)間,張永根等研究,利用復(fù)合乳酸菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣與麩皮混合物,可降低其pH值,延長(zhǎng)其貯藏時(shí)間[8],與本試驗(yàn)結(jié)果一致。
本試驗(yàn)采用植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合固態(tài)發(fā)酵豆渣,最佳發(fā)酵工藝條件為:接種量2‰,含水量70%,發(fā)酵溫度36℃,發(fā)酵時(shí)間72 h。在最佳發(fā)酵條件下,發(fā)酵底物NDF含量為36.09%,比發(fā)酵前下降了27%,總酸含量為3.45%,比發(fā)酵前提高了1.9倍,pH值降為3.75,使其成為一種低pH值、耐貯存并有助于提高動(dòng)物腸道健康的新鮮飼料原料,且此發(fā)酵方案在養(yǎng)殖場(chǎng)具有實(shí)際操作性。