張 珂,姜 橫,孟怡辰,周許輝
海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科,上海 200003
青少年特發(fā)性脊柱側凸(AIS)是最常見的脊柱畸形,其病因未明[1]。椎旁肌的不平衡在AIS的發(fā)生和進展中具有重要作用[2]。有文獻報道,AIS患者兩側椎旁肌的肌電活動和肌纖維類型存在差異,且與患者的側凸角度進展相關[3]。本研究組前期通過影像學測量發(fā)現(xiàn),AIS患者兩側椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱[4]。另有研究顯示,AIS患者兩側椎旁肌褪黑素受體和轉化生長因子-β信號通路相關分子表達不對稱,但對于上述椎旁肌的復雜改變的分子機制仍鮮有報道[5-6]。
微RNA(miRNA)通過調控基因表達在多種生物過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究顯示,一些肌肉特異性miRNAs能調節(jié)肌肉的各項功能,包括成肌細胞增殖、分化、收縮性能和壓力反應等[8-9]。另外,肌肉特異性miRNA也與心臟肥大、心力衰竭、心律失常、先天性心臟病和肌營養(yǎng)不良等肌肉相關性疾病密切相關[10-11]。因此,本研究欲探尋調節(jié)患者椎旁肌改變的關鍵miRNA及其臨床意義。
選擇2014年1月—2016年9月本院收治的漢族女性AIS患者30例。納入標準:①AIS診斷明確;②側凸Cobb角> 40°;③臨床資料和影像學資料完整;④不伴椎間盤突出、峽部裂等其他脊柱疾病,既往無針對肌肉功能治療史或其他脊柱手術史。所有患者均被告知研究內容并簽署知情同意書。凹側與凸側椎旁肌組織為盡量遠離電刀處理過的多裂肌組織500 ~ 1 000 mg(約黃豆大小),去除壞死組織和殘留血漬后置入凍存管,并迅速置于液氮罐內保存。
所有患者術前拍攝標準站立位脊柱全長正側位X線片,測量側凸Cobb角并記錄頂椎位置。使用電子病歷收集患者臨床信息,包括手術年齡、月經(jīng)初潮時間、是否進行過支具或牽引等治療。
取其中3例在發(fā)病年齡、手術年齡、Lenke分型、角度大小、Risser征等參數(shù)相匹配的患者凹側和凸側椎旁肌組織,提取總RNA,測定RNA純度與質量,在5’和3’端分別連接接頭序列,形成帶有接頭的單鏈RNA,反轉錄生成RNA/DNA雜交鏈,PCR擴增構建small RNA-seq cDNA文庫,采用illumina Hiseq測序平臺(上海晶能生物有限公司,中國)單端測序模式進行高通量測序。
取其余27例患者的椎旁肌組織,驗證高通量測序的質量及差異miRNAs的表達情況。使用TRIzol(Invitrogen公司,美國)提取椎旁肌組織總RNA,用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo公司,美國)測定RNA濃度與純度。采用SYBR GreenⅡ20 μL體系擴增miRNA。具體反應體系、反應程序根據(jù)試劑盒說明書設定(TaKaRa公司,日本),以U6 snRNA作為內參。實時熒光定量PCR反應條件:95℃起始激活3 min;95℃變性12 s、62℃退火40 s、72℃延伸45 s,40個循環(huán);最終72℃延伸5 min。采用ΔCt法計算miRNA的相對表達量。
采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。兩側椎旁肌組織相關miRNA表達水平的比較采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗。采用Pearson相關性分析對兩側miRNAs相對表達量的差值與患者臨床信息(手術年齡、術前側凸Cobb角)的關系進行分析,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
由miRNAs聚類熱圖(圖1)可知,AIS患者凹側和凸側椎旁肌存在差異表達miRNA。共有18個miRNA表達有差異,其中凹側較凸側表達量增加的12個,增加倍數(shù)最大的是miR-424;凸側較凹側表達量增加的6個,增加倍數(shù)最大的是miR-517(表1)。
圖1 AIS患者兩側椎旁肌組織差異miRNA聚類熱圖(n=3)Fig. 1 MiRNAs clustering thermal map of bilateral paraspinal muscles in AIS patients(n=3)
表1 AIS患者兩側椎旁肌miRNA表達差異Tab. 1 Differences in miRNAs expression between bilateral paraspinal muscles in AIS patients n=3
為驗證高通量測序的質量和測序篩選獲得差異miRNAs的表達情況,在27例AIS患者兩側椎旁肌組織中對測序結果中變化倍數(shù)最大的6個miRNA進行表達驗證,分別為凹側含量較高的miR-424、miR-433、miR-769和凸側含量較高miR-516、miR-517、miR-495。目標miRNA的相對表達量(ΔCt)=Ct目標miRNA表達量-CtU6。實時熒光定量PCR結果顯示僅miR-516、miR-517和miR-495的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖2)。
相關性分析顯示,兩側椎旁肌miR-516相對表達量差值與患者發(fā)病年齡呈負相關(r=-0.452),miR-517相對表達量差值與側凸Cobb角呈負相關(r=-0.378)。
圖2 AIS患者兩側椎旁肌差異表達miRNA驗證(n=27)Fig. 2 Veri fi cation of differential expression of miRNAs in bilateral paraspinal muscles of AIS patients(n=27)
AIS患者側凸角度有進展風險,目前臨床上主要處理措施是佩戴支具預防角度進展,針對大角度的側凸進行手術矯形。患者隨訪檢查接受的輻射、高昂的手術費用和繼發(fā)的心肺功能障礙造成了巨大的社會負擔[12]。對AIS發(fā)生機制的深入研究有助于更好地為疾病的診斷、治療甚至預防提供新思路。由于遺傳異質性和缺乏合適可靠的動物模型,目前AIS的病因和病理機制尚未明確[13]。有學者認為,在AIS的發(fā)生和進展中,椎旁肌組織的代償性功能能維持脊柱的穩(wěn)定性,當肌肉力量不足時,椎體內在的旋轉不穩(wěn)定導致側凸角度增大[2,14-15]。上述研究主要從功能學和形態(tài)學方面闡述AIS患者兩側椎旁肌的不對稱,卻未對產(chǎn)生這種改變的分子機制進行闡述。本研究通過RNA高通量測序發(fā)現(xiàn)AIS患者兩側椎旁肌miR-516、miR-517、miR-495存在差異表達,且miR-516的相對表達差值與患者手術年齡呈負相關,miR-517的相對表達差值與患者側凸Cobb角呈負相關。
有研究報道,在凹側椎旁肌表達升高的miR-495與骨骼肌的再生關系密切[16]。miR-495位于Gtl2-Dio3基因座[17],Gtl2-Dio3編碼的miRNA能抑制分泌型卷曲相關蛋白(sFRP)的分泌,后者是Wnt信號轉導通路的抑制劑。動物實驗表明Gtl2-Dio3編碼的miRNA(包括miR-495)在再生MEF2A敲除肌組織中表達下調,導致sFRP的表達上調和Wnt信號通路的活性減弱[18]。因此,miR-495在MEF2A的調控下對Wnt信號轉導的調節(jié)在骨骼肌的再生過程中發(fā)揮重要作用。
miR-516和miR-517共同位于C19MC基因簇內[19-20]。有研究表明,該基因簇內的miRNA在成體組織中的表達量均較?。?1],而在早期胚胎發(fā)育過程中顯著高表達[22]。該基因簇內的miRNA的調控功能大多與腫瘤的發(fā)生相關[23]。目前miR-516和miR-517在骨骼肌發(fā)育或AIS的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用尚未見報道。
本研究組前期發(fā)現(xiàn)AIS患者兩側椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱[4],本研究結果提示兩側椎旁肌中與骨骼肌再生相關的miRNA表達存在差異,推測在應力或青春期各種內外因素的作用下,兩側椎旁肌的miRNA表達發(fā)生改變,異常表達的miRNA通過調控特異性靶基因的表達而引起肌細胞生長發(fā)育和其他功能的變化,導致兩側椎旁肌收縮性能出現(xiàn)差異,最終引起側凸的出現(xiàn)或加重。miRNA在AIS患者兩側椎旁肌中差異表達的機制仍需進一步研究,以解釋其介導椎旁肌不平衡改變的作用機制。