發(fā)酵羊乳及其抗氧化活性肽的研究

馬嵐，趙存朝，黃艾祥

(1.云南省瀘西縣農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)保護(hù)站，云南瀘西 652499；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

0 引 言

山羊乳營養(yǎng)豐富、易于吸收是乳品中的精品，主要營養(yǎng)成分含量均高于牛乳和人乳，其中酪蛋白、氨基酸和低聚糖組成模式接近母乳，具有獨(dú)特的生物活性性質(zhì)，是一種理想的牛乳替代品[1-6]。山羊乳營養(yǎng)研究結(jié)果再次把山羊乳推薦為“替代牛乳治療營養(yǎng)不良兒童的有益選擇”，其中含有某些生長(zhǎng)因子和生物活性物質(zhì)，而這些物質(zhì)在牛奶中可能并不存在[7]。近年來，乳及乳制品中的生物活性肽功能被大量研究。生理功能活性肽是從多種食物蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸消化和食品原料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而產(chǎn)生[8]。許多乳蛋白衍生肽具有抗菌、降血壓、抗血栓形成、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性[9]。Korhonen等從酶消化的各種食物蛋白質(zhì)中分離出降壓肽或ACE抑制肽[10]，Nakamura等利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵脫脂乳純化出ACE抑制肽[11]，Gobbetti等經(jīng)嗜熱菌蛋白酶水解山羊β-乳球蛋白純化出4種新的ACE抑制肽[12]；Suetsuna等證明αs-酪蛋白衍生肽具有清除自由基活性并能抑制酶促和非酶促脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[13]；IL Expósito等經(jīng)胃蛋白酶水解綿羊乳發(fā)現(xiàn)4種抗菌肽。更多的研究表明源于山羊乳的抗血栓肽[14]、酪蛋白磷酸肽[15]、阿片類活性肽[16]等受到人們的極大關(guān)注。

酸奶一直被認(rèn)為是一種功能性食品，除了含營養(yǎng)素外，還含有促進(jìn)身體功能的成分[17]。酸奶在制作過程中加入活菌，增加酸乳制品的營養(yǎng)質(zhì)量和風(fēng)味。益生菌可以通過活菌在體內(nèi)直接作用，另外，通過活菌細(xì)胞代謝產(chǎn)物間接作用，發(fā)酵乳中的多肽如酪新素[18]、酪激肽[19]、降血壓肽[20]、乳鐵蛋白肽[21]、凝血素抑制肽[22]等一些還沒被具體鑒定的肽。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酸奶及其細(xì)菌性成分對(duì)宿主免疫系統(tǒng)及其疾病控制起到了重要的作用，如免疫刺激特性[23]、腸道疾病[24]、癌癥[25]、心血管疾病[26]、乳糖不耐癥等[27]。本研究通過篩選高產(chǎn)抗氧化活性肽的乳酸菌，利用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)肽條件進(jìn)行優(yōu)化確定最優(yōu)產(chǎn)肽參數(shù)，進(jìn)而采用二次通用旋轉(zhuǎn)研制一種高產(chǎn)抗氧化肽的山羊發(fā)酵乳，并經(jīng)體外胃腸道模擬測(cè)試山羊發(fā)酵乳抗氧化穩(wěn)定性，同時(shí)促進(jìn)山羊乳資源的開發(fā)利用，為抗氧化功能性乳制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與菌株

L-谷光甘肽，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、30%過氧化氫（H2O2）、2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS），上海晶純生化科技股份有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶,索萊寶生物科技有限公司。

CICC 6063嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)；CICC 6064瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)；CICC 20264植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)；CICC 20022植物乳桿菌亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)；CICC 20241副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)；CICC 20262干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)；CICC 22150嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

URA14M 0018分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機(jī)，北京世紀(jì)陽光；UL40BC乳成份分析儀，杭州浙大優(yōu)創(chuàng)科技有限公司；SW-CJ-IF單人雙面超凈無菌操作臺(tái)，蘇州江東精密儀器有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GMSX-280壓力蒸汽滅菌器，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性肽的提取

取100 mL山羊乳85℃滅菌15 min，冷卻至45℃，接種乳酸菌，42℃發(fā)酵后4℃冷藏12 h，沸水浴滅酶10 min，4℃ 4 000×g離心10 min，取上清液，4℃冷藏備用。

1.2.2 發(fā)酵羊乳菌種篩選

（1）菌種活化分別取適量乳桿菌菌株凍干菌粉接種于10 mL滅苗MRS肉湯培養(yǎng)基中，旋渦混勻于37℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h得到一代菌懸液。按5%的接種量將一代菌懸液接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h得二代菌懸液。重復(fù)上述步驟37℃恒濕培養(yǎng)18 h，進(jìn)行第三次活化得到三代活化菌懸液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（2）菌種馴化將活化后的乳酸菌接種到山羊乳中訓(xùn)化增殖，依次調(diào)整菌種接種量為8%，4%，2%，40℃恒溫培養(yǎng)至凝乳，保證菌種活力能在4 h內(nèi)凝乳。

（3）高產(chǎn)抗氧化肽菌種篩選按3%的接種量分別接種7株乳酸菌于滅菌山羊乳中，以水解度及ABTS自由基清除活性為指標(biāo)，篩選高產(chǎn)抗氧化肽菌種。

1.2.3 發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽工藝優(yōu)化

（1）發(fā)酵羊乳菌種配比

選取水解度及ABTS自由基清除能力最大的乳酸菌與嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌以4%的接種量按（1∶1∶1；1∶2∶1；1∶1∶2；2∶1∶1；1∶1∶3））5種配比進(jìn)行復(fù)配，接種發(fā)酵后取上清液測(cè)定水解度及ABTS自由基清除能力，確定山羊發(fā)酵菌種的最佳配比。

（2）發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽的單因素實(shí)驗(yàn)

以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察接種量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）、發(fā)酵時(shí)間（6、7、8、9、10、11 h）、后熟時(shí)間（4、8、12、16、20、24 h）3個(gè)因素對(duì)其的影響，確定響應(yīng)面最佳因素水平。

（3）響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以水解度為響應(yīng)值，選取水解度影響較為顯著的A接種量、B發(fā)酵時(shí)間、C后熟時(shí)間3個(gè)因素，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化發(fā)酵山羊乳產(chǎn)抗氧化肽的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平

1.2.4 水解度測(cè)定

水解度測(cè)定采用甲醛滴定法。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

（1）DPPH·自由基清除能力測(cè)定參考等SLin的方法[28]。谷光甘肽作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 為 ：y=0.301x+0.203（0.301～1.81 mg/mL，R2=0.996）；y為DPPH自由基清除率，x為谷光甘肽濃度。

（2）還原能力測(cè)定參考徐懷德等的方法[29]。谷光甘肽作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0003x+0.0435（301～1806 mg/mL，R2=0.9986）；y為吸光度，x為谷光甘肽濃度。

（3）總抗氧化能力測(cè)定（TEAC）參考T Valeriaa等的方法[30]。谷光甘肽作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.004x+0.027（30.1μg/mL～180.6μg/mL，R2=0.996）；y為ABTS自由基清除率，x為谷光甘肽濃度。

1.2.6 發(fā)酵羊乳的研制

（1）工藝流程

山羊乳100 kg→65℃預(yù)熱→6～8 MPa均質(zhì)→85℃殺菌15 min→冷卻至45℃→接種發(fā)酵劑→灌裝→發(fā)酵→冷藏→成品

（2）發(fā)酵羊乳單因素實(shí)驗(yàn)

以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察糖添加量（7%、7.5%、8%、8.5%、9%）、淡奶油添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、發(fā)酵溫度（38、40、42、44、46℃）3個(gè)因素對(duì)其影響，確定二次通用旋轉(zhuǎn)最佳因素水平。

（3）二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)因素水平表

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇糖添加量、淡奶油添加量和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)因素水平表

（4）感官評(píng)價(jià)

組織15位具有一定專業(yè)知識(shí)的人員經(jīng)培訓(xùn)組成評(píng)價(jià)小組，分別從色澤1分、氣味2分、滋味4分及組織狀態(tài)3分4個(gè)方面對(duì)山羊發(fā)酵乳進(jìn)行評(píng)定，最后得分為15位評(píng)分員評(píng)分的算術(shù)平均值。具體以上感官項(xiàng)目權(quán)重的分布見表3。

表3 山羊奶發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.7 模擬胃腸道消化

人工模擬腸液的配制：磷酸氫二鉀6.89 g，加500 mL蒸餾水溶解，再用0.4 mol/L NaOH溶液將其pH調(diào)至6.8，另取胰蛋白酶10 g加適量蒸餾水溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL。

人工模擬胃液的配制：將23.4 mL濃鹽酸加水稀釋至100 mL得到稀鹽酸，取16.4 mL稀鹽酸，加水約800 mL與10 g胃蛋白酶，混勻后加水稀釋至1 000 mL。

取山羊奶發(fā)酵乳5 mL，4℃4000×g離心10 min，取上清液測(cè)定抗氧化活性。山羊奶發(fā)酵羊乳p H值調(diào)至2.0，然后取1 mL接于含9 mL的人工胃酸試管中，充分混勻后37℃保溫2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)。測(cè)定消化前后的抗氧化活性。再將其p H調(diào)至6.8，以1∶9的體積比加入至人工腸液中，于37℃恒溫水浴中模擬消化2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，再取樣測(cè)定其抗氧化。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵羊乳菌種篩選

乳酸菌沒有假單胞菌、枯草桿菌、地衣芽胞桿菌等的蛋白水解力，但其對(duì)乳制品蛋白水解具有改善制品風(fēng)味和質(zhì)地的作用,在干酪成熟中乳酸菌的蛋白水解及菌體破裂后釋放的酶發(fā)揮著重要作用。由圖1可以看出，7株乳酸菌在相同條件下ABTS自由基清除能力及水解度不同，且山羊乳蛋白水解度及ABTS自由基清除能力具有相關(guān)性；副干酪乳桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解能力及抗氧化活性，可用于山羊發(fā)酵乳的制作。

圖1 高產(chǎn)抗氧化肽的山羊發(fā)酵乳菌種篩選

2.2 發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽工藝優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵羊乳菌種配比

圖2 乳酸菌配比對(duì)產(chǎn)抗氧化肽的影響

在酸奶、Mozzarella干酪的發(fā)酵過程中、混合菌株間的共生作用讓蛋白水解以促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)；由圖2可知：試驗(yàn)采用傳統(tǒng)發(fā)酵菌嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌及篩選的高產(chǎn)抗氧化肽菌株副干酪按不同比例進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)1∶1∶2的比率能有效促進(jìn)山羊乳蛋白水解且具有較強(qiáng)的抗氧化活力。

2.2.2 接種量對(duì)發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽的影響

圖3 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵山羊乳產(chǎn)抗氧化肽的影響

如圖3所示：隨著接種量的增加，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在接種量為4%處達(dá)到最大值。隨著接種量的繼續(xù)增加，水解度反而降低，可能是由于山羊乳中的蛋白難以滿足過多菌體生長(zhǎng)需求，產(chǎn)酸過多抑制了蛋白的水解；或菌體釋放的蛋白酶不利于在強(qiáng)酸條件下作用，活性被抑制。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)羊乳產(chǎn)抗氧化肽的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)山羊乳產(chǎn)抗氧化肽的影響

由圖4可以得出：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，山羊乳發(fā)酵在不過進(jìn)行，水解度呈上升趨勢(shì)，但在發(fā)酵9h后，山羊發(fā)酵乳水解度趨于平緩；可能是由于隨著發(fā)酵乳發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，羊乳中營養(yǎng)物質(zhì)不足，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)。

2.2.4 發(fā)酵羊乳后熟時(shí)間對(duì)產(chǎn)抗氧化肽的影響

圖5 后熟時(shí)間對(duì)山羊乳產(chǎn)抗氧化肽的影響

由圖5可知：隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度吳上升趨勢(shì)，山羊發(fā)酵乳的水解度緩慢增加；可能因?yàn)殡S著發(fā)酵乳，發(fā)酵進(jìn)行，羊乳中營養(yǎng)物質(zhì)不足，為保證自身生產(chǎn)需要，乳酸菌菌體內(nèi)的蛋白酶將多肽講一步水解，從而表現(xiàn)出水解度緩慢上升。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^擬合二次方程計(jì)算最優(yōu)工藝組合以及發(fā)酵山羊乳最大理論水解度。選擇接種量（X1）、后熟時(shí)間（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表3進(jìn)行多元回歸擬合，得到山羊發(fā)酵乳水解度與菌種添加量/%（X1）、后熟時(shí)間（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）的二次方程模型為：Y=8.29+0.82X1-0.069X2+0.80X3-0.33X1X2+0.57X1X3+0.092X2X3-1.10X12-0.81X22-0.84X32回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表4 水解度回歸模型方差分析表

由表3方差分析可知：水解度回歸模型顯著性檢驗(yàn)P=0.0001＜0.01，說明二次多元回歸模型極顯著；水解度回歸模型失擬性檢驗(yàn)P=0.1305＞0.05，可以認(rèn)為所選山羊發(fā)酵乳水解度二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。山羊發(fā)酵乳水解度回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=98.32%，信噪比Adeq precisior=3.16，這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于山羊發(fā)酵乳水解度評(píng)價(jià)。離散系數(shù)C.V（Y的變異系數(shù)）表示實(shí)驗(yàn)本身的精確度，C.V值越小，實(shí)驗(yàn)的可靠性越高，水解度擬合C.V值為3.16%。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)山羊發(fā)酵乳水解度，說明實(shí)驗(yàn)操作可信度高，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。由回歸系數(shù)顯著性表明，在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)山羊乳水解度影響的順序?yàn)椋航臃N量＞發(fā)酵時(shí)間＞后熟時(shí)間。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化

通過觀察圖6圖7中響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映山羊發(fā)酵乳菌種添加量/%（X1）、后熟時(shí)間（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）交互作用對(duì)水解度的影響，當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著。

圖6 菌種添加量/%（X 1）、后熟時(shí)間（X 2）對(duì)水解度的影響

圖7 后熟時(shí)間（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）時(shí)間對(duì)水解度的影響

圖6圖7為有二次回歸方程擬合得到的響應(yīng)值Y的等高線及三維曲面圖，是回歸方程的形象描述。由圖可知，X1與X2，X1與X3之間交互作用顯著（P＜0.05），對(duì)山羊乳水解度影響較大；由圖6可知，山羊發(fā)酵乳隨后熟時(shí)間和菌種添加量的增加而提高后趨近于平緩，后熟時(shí)間及添加量為12 h及4%時(shí)，山羊發(fā)酵乳趨于平緩，與單因素和方差分析結(jié)果相符。由圖7可知，發(fā)酵時(shí)間及添加量變化曲面比較陡峭，隨著發(fā)酵時(shí)間及添加量的增加水解度的呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)；交互作用顯著與方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

回歸模型通過響應(yīng)面法得到最優(yōu)山羊發(fā)酵乳產(chǎn)肽工藝條件為菌種添加量4.31%，后熟時(shí)間10.99 h，發(fā)酵時(shí)間9.54 h?？紤]實(shí)際操作情況與設(shè)備參數(shù)狀況，確定山羊發(fā)酵乳產(chǎn)肽工藝條件為：菌種添加量4%，后熟時(shí)間11 h，發(fā)酵時(shí)間9.5 h，山羊發(fā)酵乳水解度預(yù)測(cè)值8.69%。在上述最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到山羊發(fā)酵乳水解度平均值9.43%，與理論值接近。

2.4 發(fā)酵羊乳單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察糖添加量、淡奶油添加量、發(fā)酵溫度個(gè)因素對(duì)其影響，確定二次通用旋轉(zhuǎn)最佳因素水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8-圖10。

圖8-圖10為發(fā)酵羊乳不同糖的添加量、淡奶油添加量、發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)分影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果。由圖8可知：隨著糖的添加量增加，感官評(píng)分值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，糖的添加量為8%時(shí)山羊發(fā)酵乳感官評(píng)分值最高為8%；由圖9可知：淡奶油添加量增加，感官評(píng)分只增加，但超過1.5時(shí)山羊發(fā)酵乳的獨(dú)特膻味被掩蓋，失去了山羊發(fā)酵乳原有風(fēng)味，故選取最適添加量為1.5%；由圖10可知：隨著發(fā)酵山羊乳溫度的增加，感官評(píng)分值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在40℃時(shí)，山羊綜合感官評(píng)分值最優(yōu)，但超過40℃時(shí)，山羊發(fā)酵乳不同程度的出現(xiàn)乳清析出，影響感官評(píng)分指標(biāo)，故選取最適溫度為40℃。

2.5 發(fā)酵羊乳二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)

2.5.1 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇糖的添加量、淡奶油添加量（%）和發(fā)酵溫度（%）3個(gè)因素，采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

2.5.2 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。利用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為：Y=7.92216+0.00815X1+0.35746X2+0.01724X3-0.28935X12-0.12848X22+0.04122X32+0.02375X1X2-0.21375X1X3-0.12125X2X3

2.5.3 變量輪換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.682≤X i≤1.682（i＝1，2，3）范圍內(nèi)，每個(gè)因素取5個(gè)水平（±1.682，±1，0），對(duì)53=125個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)感官評(píng)分最高值為8.59，此時(shí)各因素取值為：X1＝-1，X2=1.682，X3＝1.682，對(duì)應(yīng)著糖的添加量7.5%，淡奶油添加量2.34%，發(fā)酵溫度43℃。

2.5.4 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)

圖8 糖的添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

圖9 淡奶油添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

圖10 發(fā)酵油溫度對(duì)感官評(píng)分的影響

對(duì)不同設(shè)計(jì)水平下的組合進(jìn)行模擬試驗(yàn)，以均值7.66為臨界值，獲得大于臨界值的方案49個(gè)，各變量取值的頻率分布見表7。

由表7可以看出，在95%的置信區(qū)間感官評(píng)分值大于7.66的優(yōu)化方案為：糖的添加量7.3505%～7.6495%，淡奶油添加量為1.057%～1.943%，發(fā)酵溫度為39.3℃～40.7℃。為了貼近實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：糖的添加量7.5%，淡奶油添加量為1.5%，發(fā)酵溫度為40℃。

2.6 發(fā)酵羊乳在模擬胃腸液中抗氧化的變化

食物進(jìn)入口腔、食管、胃、十二指腸、小腸、大腸時(shí)，胃是主要的消化場(chǎng)所，把大分子物質(zhì)（主要是糖與蛋白質(zhì)）分解為小分子；十二指腸也是消化的場(chǎng)所，主要是消化脂類；小腸是最主要的吸收?qǐng)鏊?，大部分營養(yǎng)都在小腸吸收；大腸是貯存食物殘?jiān)膱?chǎng)所，同時(shí)吸收少量水分。經(jīng)人工胃液、人工腸液消化后，發(fā)酵羊乳中抗氧化活性變化如表8所示。

表5 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果

表6 回歸方程方差分析表

表7 優(yōu)化提取方案中X i取值頻率分布表

由表8可見，山羊發(fā)酵乳中含有抗氧化活性肽，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力；經(jīng)模擬胃液和腸液消化試驗(yàn)后，抗氧化活性較消化前有所下降，但下降幅度較小，消化后抗氧化活性依然存在，可見混合發(fā)酵菌株產(chǎn)生的活性肽經(jīng)胃胰蛋白酶水解后，生成的產(chǎn)物仍具有一定的抗氧化活性。

表8 體外模擬胃腸道前后山羊乳多肽抗氧化活性變化

3 結(jié) 論

傳統(tǒng)發(fā)酵菌株保加利亞乳桿菌及與副干酪乳桿菌按1∶1∶2的菌株比例復(fù)配，山羊發(fā)酵乳水解度較高、ABTS自由基清除活性較強(qiáng)；通過響應(yīng)面及二次通用旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵羊乳的最適菌種添加量4%、蔗糖7.5%、淡奶油1.5%、40℃發(fā)酵9.5 h、后熟時(shí)間11 h。產(chǎn)品色香味俱佳、無明顯羊奶膻味，還原能力、總抗氧化、DPPH自由基清除等抗氧化活性較強(qiáng)。發(fā)酵羊乳的研究，為特色乳制品的開發(fā)提供參考，有利于促進(jìn)羊乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。