動物源性食品中氯霉素殘留的快速篩查方法

陳軍

(蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215021）

0 引 言

氯霉素作為一種殺滅或抑制細(xì)菌生長的藥物，曾在一段時間內(nèi)作為飼料添加劑和獸醫(yī)臨床常用藥品，因其通過水產(chǎn)品、肉制品、奶、蛋等對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用[1]，因而美國和歐共體已禁止在動物飼料中使用氯霉素，并規(guī)定在動物源食品中不得檢出[2]。有關(guān)氯霉素在水產(chǎn)品、畜產(chǎn)品中殘留的檢測方法，國內(nèi)外報道很多，包括微生物法[3-5]、色譜法[6-8]、免疫測定法[9-10]等，新型生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展催生了生物膜干涉技術(shù)[11-15]。本文提出一種針對動物源性食品中氯霉素殘留檢測的免疫分析方法，以氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)為母體直接偶聯(lián)物固著在光纖探頭表面，再由光纖光譜分析裝置檢測和識別待測樣品中是否存在目標(biāo)物以及濃度信息，實現(xiàn)樣品中氯霉素的定量檢測。

1 實驗

1.1 儀器

Octet?RED 96 System生物分子相互作用儀，紫外可見分光光度儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍離心機，臺式冷凍離心機，臺式真空泵，磁力攪拌器。

1.2 試劑

牛血清白蛋白(BSA)，電泳純（進(jìn)口分裝）；人血清白蛋白(HSA)，電泳純（進(jìn)口分裝）；氯霉素(CAP)，琥珀酸酐(HS，化學(xué)純），三正丁胺（化學(xué)純），氯甲酸乙酯（化學(xué)純），其他試劑均為AR級。

1.3 方法

1.3.1 免疫原和包被原的制備

（1）氯霉素半琥珀酸酯制備。將CAP、HS、丙酮、吡啶按適當(dāng)比例混合、攪拌溶解，58～60℃回流2 h，濃縮、蒸去丙酮，加乙酸乙酯和稀鹽酸振蕩去酸層，用10%NaHCO3轉(zhuǎn)溶，加濃鹽酸調(diào)pH值到3，析出糖漿狀物，再用酸乙酯萃取，取有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)，備用。

（2）氯霉素包被原制備。稱取CAP-HS 21.7 mg溶于3 mL DMF中，4℃預(yù)冷10 min，依次加入三丁胺、氯甲酸異丁酯，4℃攪拌20 min；按50∶1的摩爾比(CAP/BSA)稱取BSA，溶于50%的DMF 10 mL中，4℃預(yù)冷，用1 mol/L的NaOH調(diào)BSA至p H值為8；將前述CAP-HS液迅速加入BSA中，4℃攪拌反應(yīng)4 h。所得產(chǎn)物以0.05 mol/L pH7.4的PBS透析3 d，得氯霉素包被原Hap-BSA。

（3）氯霉素免疫原制備。稱取48 mg OVA和10 mg氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05 mol硼砂緩沖液(pH 8.5，含0.15 mol NaCl)中，4℃攪拌，將所得1.5 mL溶液逐滴加入到該溶液中，避光反應(yīng)1 h，得氯霉素包被抗原Hap-OVA。

（4）金標(biāo)氯霉素包被原制備。向1 mL膠體金中加入1μL質(zhì)量濃度為0.5 g/L的氯霉素抗體，渦旋混勻，室溫靜置15 min，加入100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的BSA濃液，室溫封閉顆粒15 min，在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min下離心10 min，棄掉上層清液，加入90μL PB(pH=7.4)，重懸顆粒，備用。

1.3.2 光纖生物傳感器的制備

將APS光纖傳感器末端置于不同濃度的氯霉素-BSA偶聯(lián)物溶液中，室溫靜置5 min后再將光纖生物傳感器沒入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%蔗糖中，室溫靜置1 min。室溫晾干，置于2～8℃下干燥保存。

1.3.3 牛乳中氯霉素殘留檢測

采用無標(biāo)記檢測和膠體金標(biāo)記檢測2種方式對牛乳中氯霉素殘留進(jìn)行檢測。

(1)無標(biāo)記BLI檢測。將光纖傳感器末端沒入空白奶液中(200μL牛乳+50μL緩沖液)中120 s進(jìn)行平衡，再將光纖傳感器末端沒入末端置于待測奶液(200 μL待測牛乳+50μL緩沖液+2μg氯霉素單克隆抗體)中300 s檢測牛乳中氯霉素殘留量。

(2)金標(biāo)記BLI檢測。將光纖傳感器末端置于奶液中(200μL牛乳+50μL緩沖液+5μL金標(biāo)BSA)中平衡120 s;然后，將光纖傳感器末端沒入待測奶液(200μL待測牛乳+50μL緩沖液+5μL金標(biāo)氯霉素素單克隆抗體)中700 s。檢測牛乳中氯霉素殘留量。

1.3.4 膠體金免疫層析檢測

使用膠體金試紙條檢測梯度稀釋的添加氯霉素的牛乳樣品，每個濃度重復(fù)3次，具體操作參照牛乳中氯霉素快速檢測試紙條說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度實驗

(1)無標(biāo)記BLI檢測。用巴氏殺菌奶將該抗體稀釋成質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL的牛奶樣本檢測結(jié)果，然后用該液體將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度稀釋到100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和 0 ng/mL，進(jìn)行無標(biāo)記BLI檢測上機檢測，結(jié)果表明靈敏度為2.0 ng/mL(圖1)。

圖1 無標(biāo)記BLI檢測牛奶中氯霉素殘留實驗結(jié)果

(2)金標(biāo)記BLI檢測。用氯霉素陰性巴氏殺菌奶將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至100，50，25，12.5，6.25，3.12 ng/mL和0 ng/mL。采用金標(biāo)記BLI檢測，檢測靈敏度為0.0125 ng/mL(見圖2)，圖3為重復(fù)檢測6次氯霉素質(zhì)量濃度為0.1ng/mL的牛奶樣本檢測結(jié)果。

圖2 金標(biāo)記BLI檢測牛乳中氯霉素殘留實驗結(jié)果

圖3 金標(biāo)記BLI重復(fù)檢測氯霉素加標(biāo)樣品

由圖3可以看出，采用金標(biāo)記信號放大技術(shù)建立了檢測樣品中四環(huán)素類抗生素殘留的方法，說明方法具有良好的靈敏性，可適用于四環(huán)素類抗生素殘留的快速定量檢測。

2.2 氯霉素特異性試驗

用建立的金標(biāo)記BLI方法檢測加標(biāo)質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的三聚氰胺、頭孢哌酮、恩諾沙星、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素，檢測結(jié)果均為陰性。說明所制備的單抗對氯霉素具有一定的特異性。

2.3 基質(zhì)對靈敏度的影響

分別用6份原奶、7份來自不同批次的巴氏殺菌奶倍比稀釋氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別采用金標(biāo)記BLI檢測方式進(jìn)行檢測，靈敏性穩(wěn)定達(dá)到0.0125 ng/mL。

2.4 實際樣品中氯霉素殘留檢測結(jié)果

使用氯霉素快速檢測試紙條及LC-MS/MS評價金標(biāo)記BLI方法的可靠性，檢測20份兩個加標(biāo)水平的牛乳樣品中氯霉素殘留，金標(biāo)記BLI與所采用的對照方法的結(jié)果見表1，其靈敏度優(yōu)于膠體免疫層析試紙條，檢測結(jié)果與LC-MS/MS一致。

表1 金標(biāo)記BLI、膠體金免疫層析試紙條及LC-MS/MS檢測牛乳加標(biāo)氯霉素殘留 ng/mL

3 討 論

利用生物膜干涉技術(shù)建立快速檢測動物源性食物樣品中氯霉素殘留的快速篩查方法。本實驗采用膠體金信號放大檢測牛奶中的氯霉素，建立了一種快速檢測動物源性食品中氯霉素殘留的方法，其檢測靈敏性在0.0125 ng/mL以下，與恩諾沙星、三聚氰胺、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等無交叉反應(yīng)。該試驗結(jié)果表明采用相同的抗原、抗體、納米金、緩沖液及納米金標(biāo)記抗體工藝，金標(biāo)記生物膜干涉技術(shù)檢測氯霉素殘留的靈敏性要明顯高于免疫層析試紙條的靈敏性，其檢測結(jié)果與經(jīng)典儀器分析一致。

該試驗表明采用金標(biāo)記BLI技術(shù)檢測牛乳中抗生素殘留競爭結(jié)合反應(yīng)需要90 min以上的時間方能達(dá)到平臺期，在90 min以內(nèi)雖然檢測信號一直在提高，但在反應(yīng)初期即可對陰陽性結(jié)果進(jìn)行判定。另外，該研究中金標(biāo)記BLI檢測喹諾酮類抗生素的定量范圍較小，并不適用于實際生產(chǎn)中的定量檢測，是一種較好的定性檢測方法。筆者建立的方法雖然檢測周期略長于免疫層析試紙條方法(6 min)，但仍是一種簡便、快捷的檢測方法，可以用于牛乳中喹諾酮類抗生素殘留的快速檢測。

該方法還具有良好的特異性，與牛乳中常見的其他小分子物質(zhì)無交叉反應(yīng)。不同人員采用筆者所建立的方法檢測氟甲喹加標(biāo)牛乳樣品，靈敏度無顯著差異，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性。金標(biāo)記生物膜干涉檢測技術(shù)具有良好的抗干擾能力，不同的樣品基質(zhì)對于檢測的靈敏性的干擾并不明顯，檢測不同牛乳中氯霉素的靈敏性均達(dá)到2.0 ng/mL。

4 結(jié) 論

采用金標(biāo)記信號放大技術(shù)建立了檢測牛奶中氯霉素類抗生素殘留的方法，該方法具有良好的特異性及靈敏性，適用于牛奶中氯霉素殘留的快速定量檢測，檢測靈敏性在0.0125 ng/mL以下，與恩諾沙星、三聚氰胺、青霉素G、安芐青霉素、頭孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素等無交叉反應(yīng)。