甘油混合條件下微酸性電解水對(duì)奶牛乳房炎致病菌體外抑菌效果評(píng)價(jià)

呂桂芬，烏云達(dá)來，李玉坤，張學(xué)禮，趙陽，劉露

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022；2.呼和浩特民族學(xué)院環(huán)境工程系，呼和浩特 010051）

0 引 言

奶牛乳房炎是降低奶牛泌乳量、損害乳質(zhì)，危害奶牛養(yǎng)殖、制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一，它不僅會(huì)影響奶牛泌乳量，誘發(fā)其他疾病，造成消費(fèi)性飼養(yǎng)，而且重度乳房炎還會(huì)造成奶牛喪失泌乳能力，從而使部分奶牛被迫淘汰。奶牛乳房炎除了疾病引起的經(jīng)濟(jì)損失，也給人類健康及公共衛(wèi)生造成巨大危害[1-2]。臨床上，對(duì)于奶牛乳房炎的預(yù)防措施主要是采取乳頭消毒，而當(dāng)前市場(chǎng)上乳頭藥浴的主流產(chǎn)品為聚維酮碘等碘制劑消毒劑，但長期應(yīng)用含碘消毒劑，不僅對(duì)奶牛存在一定應(yīng)激性，損害乳品質(zhì)，同時(shí)也存在殘留問題，對(duì)食品安全也有一定影響[3]。

微酸性電解水（Slightly Acidic Electrolyzed Water,SAEW）是在無隔膜電解槽內(nèi)將一定比例的低濃度氯化鈉和稀鹽酸電解生成。其p H介于4.5～6.5之間，有效氯以HClO形態(tài)存在，殺菌力強(qiáng)，作用后可迅速分解且無化學(xué)污染[4]。SAEW對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、流感病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒和豬藍(lán)耳病毒等各類微生物均有較強(qiáng)的殺滅作用[4-5]。目前SAEW在食品、醫(yī)療領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用[6-10]。與其他化學(xué)消毒劑相比，SAEW殺菌后可完全還原成無毒、無殘留的普通水，排放后對(duì)環(huán)境無任何污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成危害，而且其制作成本低廉，使用簡單方便[11]?；木热耸褂脧?qiáng)酸性電解水消毒奶牛乳頭得到比較好的結(jié)果[12]，南松劍等人使用微酸性電解水沖洗奶牛乳房，除菌率達(dá)到93%[13]。但單獨(dú)使用酸性電解水藥浴乳頭，藥浴后蒸發(fā)較快，作用持續(xù)時(shí)間短，冬季乳頭干裂或凍裂的可能。甘油具有無毒、保濕、防凍功效，普遍適用于化妝品行業(yè)[14]，本研究利用SAEW的殺菌能力強(qiáng)、無毒無害、低成本、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)和結(jié)合甘油的保濕、防凍等特點(diǎn)，開發(fā)一種安全、有效、低成本并且能夠保護(hù)乳頭的乳頭藥浴新方法。

1 方 法

1.1 微酸性電解水（SAEW）的制備

微酸性電解水（SAEW）的制備使用本實(shí)驗(yàn)室自制的無隔膜酸性電解水裝置，按照自來水、氯化鈉、鹽酸的質(zhì)量比1∶0.5%∶0.1%混合，充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓笾糜谒嵝噪娊馑l(fā)生器的電解槽中，在電壓為25 V、電流為1.5 A、電極距為2.5 mm、極板面積為108 cm2進(jìn)行電解反應(yīng)20 min，使用稀HCl和NaOH微調(diào)節(jié)pH值，通過蒸餾水稀釋方法獲得實(shí)驗(yàn)所需的有效氯濃度（ACC），即得藥浴劑中使用的SAEW。SAEW的有效氯（ACC）的測(cè)定采用碘量法。

1.2 甘油對(duì)SAEW的ACC和pH的影響

取ACC為60 mg/L的SAEW，分別加入體積百分比3%和10%的甘油，存儲(chǔ)于1.5 L塑料瓶中，塑料瓶置于室內(nèi)，分別在0、0.05、0.5、1、2、6、12、24 h時(shí)測(cè)定其ACC和p H值。無加入甘油的SAEW作為對(duì)照。

1.3 體外殺菌實(shí)驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）是引發(fā)奶牛乳房炎的主要致病菌。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供；無乳鏈球菌（CVCC3940）及停乳鏈球菌（CVCC3701）菌株從中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心購買。

1.3.2 藥浴劑的配置

SAEW-1:ACC：（30±1.2）mg/L，pH:6.30±0.13，下述簡稱：SAEW（30）。

SAEW-2：ACC：（60.0±1.9）mg/L，p H:6.45±0.24，下述簡稱：SAEW（60）。

SAEW（60）+3%甘油：加入甘油，充分混合，過2 h后立即做實(shí)驗(yàn)。

SAEW（60）+10%甘油：加入甘油，充分混合，過2 h后立即做實(shí)驗(yàn)。

0.5 %聚維酮碘：將5%的聚維酮碘（5%聚維酮碘，石家莊市光華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）用無菌生理鹽水稀釋至0.5%，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 殺菌實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

取出冰柜凍存的待試驗(yàn)菌株，分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，置于恒溫箱37℃培養(yǎng)48 h；其中大腸埃希和金黃色葡萄球菌接種于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，停乳鏈球菌和無乳鏈球菌接種于THB培養(yǎng)基；取出培養(yǎng)物，選取典型菌落轉(zhuǎn)種3代備用。保證菌液的濃度在1×106～6×106cfu/mL。

1.3.3.2 對(duì)奶牛乳房炎致病菌的消毒效果實(shí)驗(yàn)

在無菌操作常溫條件下，將制備的0.1 mL菌懸液加入裝有0.9 mL的SAEW（30）、SAEW（60）、SAEW（60）+3%甘油、SAEW（60）+10%甘油、0.5%聚維酮碘中，充分混合振蕩，處理不同時(shí)間5 s、15 s后，吸取9 mL滅菌的中和劑（0.5%的硫代硫酸鈉）加入到試管中，混勻，作用10 min，進(jìn)行10倍稀釋，用于培養(yǎng)計(jì)數(shù)。同時(shí)用生理鹽水代替藥浴劑，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽性對(duì)照。

將每個(gè)平板均分成4個(gè)區(qū)域，編號(hào)，每個(gè)區(qū)域滴三滴樣液，每滴10μL。重復(fù)三次（4DP法）。所有平板均在37℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌濃度（cfu/mL）。其殺菌率由以下公式計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 甘油對(duì)SAEW的ACC和p H的影響

如圖1所示，加入甘油的SAEW隨著存放時(shí)間的延長，其ACC含量逐漸降低。放置2 h后，加入3%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到34.27 mg/L，損失43%；加入10%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到25.64 mg/L，損失57%；放置24 h后加入不同濃度甘油的SAEW的ACC損失達(dá)到90%。在6 h以內(nèi)高濃度甘油對(duì)SAEW的ACC影響明顯高于低濃度甘油，甘油濃度對(duì)ACC的影響較大。

圖1 甘油對(duì)SAEW的ACC的影響

如圖2所示，SAEW里加入不同濃度的甘油后，隨著存放時(shí)間的延長其p H值明顯下降，但2 h之內(nèi)下降速度較緩慢，保持在p H 5.5以上。2 h到6 h之間，其pH值下降速度較快，24 h后基本達(dá)到3.5。另外，甘油濃度對(duì)pH的影響不明顯。

圖2 甘油對(duì)SAEW的pH值的影響

2.2 體外殺菌實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，ACC為30 mg/L的SAEW、ACC為60 mg/L的SAEW、ACC為60 mg/L+3%的甘油、ACC為60 mg/L的SAEW+10%甘油的不同奶牛乳頭藥浴劑在反應(yīng)時(shí)間5 s內(nèi)，對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的殺菌率均大于81%，殺菌時(shí)間15s內(nèi)殺菌率均超過88%；這四種藥浴劑的殺菌效果與常用乳頭藥浴劑0.5%的聚維酮碘的殺菌效果比較，發(fā)現(xiàn)除了SAEW（30）的個(gè)別殺菌率低于聚維酮碘外，其它實(shí)驗(yàn)組基本上達(dá)到或超過對(duì)照組聚維酮碘的效果。SAEW加不同濃度的甘油后其殺菌率均大于96%，0.5%的聚維酮碘的殺菌率也超過93%。

表1 SAEW、SAEW+甘油、聚維酮碘對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果比較（n=3） %

3 討 論

目前，奶牛場(chǎng)常用消毒液有碘伏、次氯酸鈉和新潔爾滅等[15]，均需用水稀釋后使用，藥浴后蒸發(fā)較快，作用持續(xù)時(shí)間短，易造成乳房的重復(fù)感染，且對(duì)奶牛皮膚有一定的刺激和影響[16]。其中聚維酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮與碘結(jié)合形成的一種無定形復(fù)合物，對(duì)皮膚有比較好的濕潤和保護(hù)作用，因此廣泛應(yīng)用于奶牛場(chǎng)的乳頭消毒。但碘制劑消毒液有一定的殘留作用，Bogdan等人發(fā)現(xiàn)，碘消毒和乳房乳頭藥浴將增加平均牛奶碘含量從（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

與其它化學(xué)消毒劑相比，SAEW殺菌后可完全還原成無毒、無殘留的普通水，排放后對(duì)環(huán)境無任何污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成危害，而且制作成本低廉，使用簡單方便[13]。但單獨(dú)使用SAEW，藥浴后蒸發(fā)較快，尤其是冬天可能引起奶牛的干裂和凍裂等缺點(diǎn)。本研究旨在SAEW內(nèi)加入甘油而研制一種安全、對(duì)環(huán)境友好、無殘留、成本低廉并且能夠保護(hù)皮膚的新型藥浴劑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然甘油的加入會(huì)SAEW的ACC明顯下降，但在2 h之內(nèi)殘留ACC仍然能夠保持在較高水平。實(shí)驗(yàn)在ACC為60 mg/L的SAEW內(nèi)加入3%和10%的甘油，并2 h后進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)，殺菌率基本上達(dá)到或超過對(duì)照組聚維酮碘的殺菌效果。

考慮到加入甘油后的SAEW的不穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用中建議使用更高ACC的SAEW，并且現(xiàn)做現(xiàn)用，必須甘油混合后2 h之前進(jìn)行乳頭藥浴；根據(jù)天氣溫度適度調(diào)節(jié)甘油濃度，建議夏天3%，冬天最高可達(dá)10%。消毒步驟應(yīng)分兩步進(jìn)行，擠奶前和擠奶后。擠奶前的清洗和消毒，使用無甘油添加的純SAEW,該步驟融合了清水沖洗和藥浴消毒兩個(gè)步驟,簡化了生產(chǎn)程序,而且對(duì)比效果明顯[13]。擠奶后藥浴使用加入甘油的SAEW，又能消毒也有能保護(hù)皮膚。本實(shí)驗(yàn)只是室內(nèi)殺菌效果觀察，在實(shí)際應(yīng)用過程中需進(jìn)一步研究具體的消毒方法，比如沖洗、藥浴以及重復(fù)浸泡乳頭后ACC降解等試驗(yàn)，從而確定具體應(yīng)用過程中的最佳消毒方案。

4 結(jié)論

通過體外殺菌試驗(yàn)證明，在一定條件下，微酸性電解水加入甘油后其消毒效果達(dá)到聚維酮碘的同等效果。其意義在于，微酸性電解水與傳統(tǒng)碘制劑相比安全、無殘留、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，加入甘油后有一定的保護(hù)乳頭作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)開發(fā)一種安全、有效、環(huán)保的新型乳頭藥浴劑提供了理論基礎(chǔ)。